Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 93
Текст из файла (страница 93)
Однако уравнение Михаэлиса — Ментен описывает не только сравнительно простой двухстадийный механизм ферментативной реакции. предложенный Михаэлисом и Мептен (уравнение 6-10). Многие ферменты, полчиняющиеся кинстикс Михаэлиса — Ментсн, имек>т совсем другой механизм лействия, например ферменты, катализирующие реакции с 1несть1о или восемью идентифицируемыми стадиями.
Хотя уравнение 6-23 справелливо для многих ферментов, порядок и значение констант Км и У„„., для разных фермщггов различны. В этом заключается важное ограничение использования условий стационарпости для анализа ферментативной кинетики. Для дашюго фермента значения Км и У„,,„можно определить экспериментальным путем, однако сами по себе они почти ничего нс говорят о количсствс стадий реакции, их скорости и химической природе.
Тем нс менее анализ данных стационарной кинетики позволяет определять каталнтнчсскую активность ферментов и сравнивать нх между собой. Интерпретация значений Км и У „. На рис. 6-12 изображен простой графический метод, позволяющий оценивать значение Км. Более точныс значения можно получить, используя метод двойных обратных координат (доп. 6-1). Численныее значения Км для конкретных ферментов лкь гут очень сильно различаться; более того, могут различаться значения Км для субстратов одного и того же фермента (табл.
6-6). Константа Михаэлиса иногда (и часто неоправданно) используется как показатель сродства фермента к субстрату. Л значение Км зависит от таких аспектов механизма реакции, как количество и относитсльные скорости отлельных стадий. Для лвухстадийной реакции Если лимитирующей является вторая стадия реакции, то йа «й ь и выражение 6-24 упрощается до Км = Й,/йь что соответствует константе диссоциации комплекса ЕЯ (Ка).
В данных условиях Км действительно является мерой сродства фермента к субстрату в комплексе ЕЯ. Однако данная ситуация наблюдается далеко не во всех слУчаЯх. Иногла йх» и ь пРи этом Км = Я2/йь 6.3 ферментативная кинетика как подход к пониманию механизма действия ферментов [291[ 1»1»р»' »нн»» и;ц»азн Хилютрипсин Глицил-тирозинил- глиции [)[-бекюил- тирсоииамид Р-дантова 2,5 4,0 р-Галактозидаза фг»кншш»'о1 ц)1»т "ин 1.-1 рссанш Юлгстрнт .
1]гтл) 11СО, Е+Я = ЕБ = ЕР = Е+Р (6-25) л) 12 Фермент Катализа Кпрбо»нпм.»раза Лнстнлм)лин:н и ]кент) 1)-Л)сктамата Фул»ар»кя) Б»тлпк КесЛ (ЛТРа,а) [ч ООО 2000 80)0 Лцетю)холин Б» нзи.п)епю»о»клин Фумарат 0,5 "и»:р)»е»т» Схт)серне Ам [мМ1 1»ю»жш»азн ЛТР ОЛ» бм м»мт)) ЕЬЕ »юкка 0,05 ЕнФрюмюа 15 Вдругих случаях я 1 и ят имеют сравнимые значения, тогда Км остается более сложной функцией всех трех констант (уравнение 6-24). В подобных ситуациях уравнение Михаэлиса-Ментен по- прежнему применимо, наблюдается характерная зависимость с насыщением, но только Км нельзя рассматривать в качестве меры сродства фермента к субстрату.
Еше более часто наблюлаются ситуации, при которых после образования комплекса Е5 реакция протекает н несколько стадии; в таю)х случаях Км становится сложной функцией нескольких констант. Значения Унм„ также сильно различаются хтя разных ферл)ептов. Если фермент действует в соответствии с лвухстадийныл) механизлюм Михаэлиса — Ментен, то У, = лт[Е»1, где»[), — константа скорости лимитирующей стадии. Однако число стадий реакции и лимитирующая стадия могут меняться от фермента к ферменту. Рассмщрим, например, довольно распространенную ситуацию, когда лимитирующей стадии соответствует образование продукта, т. е. реакция ЕР— Е л Р. В начале реакции, когда значение [Р] невелико, суммарная реакция может быть описана следующей схемой: В дзнном случае бо,тыкая часть фермента нри насыщении находится в форме ЕР; при этом У = к,[Ц.
Для выражения скорости лимитирую- в)ей стадии ферл)ентативной реакции с насын)ением полезно ввести константу скорости 1т,. Если реакция протекает в несколько стадий, одна из которых определенно является лимити- рующей, то 7»,.„, эквивалентна константе скорости этой лимитирующей стадии. Для простого случая, описываемого уравнением 6-10, й,м» = »[э Для реакции, описываемой уравнением 6-25, /»„и =- яэ Если несколько стадий реакции являются лимитирующими, 1»„1 прслставляет собой сложную функцию нескольких констант скоростей.
В уравнении Михаэлиса — Ментен )т,„» = 1'нт / [Е, [, н уравнение 6-9 имеет вид й,„» [Е, ][5] (6-26) '" = К + [51 Константа 7», представляет собой константу скорости реакции первого порядка и, следовательно, имеет размерность, обратную времени. Иначе эту константу называют числом оборотов, п<ккольку ее значение эквивалентно числу молекул субстрата, превращенных в продукт в единицу времени на одной молекуле фермента при условии насыщения фермента субстратом.
Число оборотов некоторых ферментов представлено в табл. 6-7. Сравнение квталитических механизмов и зффектнВНОСтн ДЕйСтВИЯ фЕРМЕНтОВ. ПаРаЛ)СтРЫ )теМ И Км использунхг для изучения и сравнения различных ферментов, вне зависимости от сложности механизма их действия. Значения я»н» н Кл, каждого фермента отражают условия клеточной среды, концентрацию субстрата н реакциях и ппю, а также химическуто сущность катализируемой реакции. Кроме того, параметры тт,.„, и Км позволяют оценить каталитическую эффективность фермента, но знания лишь одного из этих параметрон недостаточно для решения данных задач. Два фермента, катализирующие различные реакции, могут характеризоваться одинаковыми значениями Йм, хотя скорости тех же реакций [292[ Часть 1.
6.4)ермеигм без катализатора различаются, слеловательно, различается и степень ускорения реакций под действием ферментов. Обычно значение Км фермента близко к значению концентрации его субстрата в клетке. Фермент, субстрат которого имеет очень низкую конпентрацию в клетке, обычно характеризуется более низким значением Км, чем фермент, субстрат которого имеет более высокую концентрацию. Наилучшим способом сравнения каталитической активности различных ферментов или воздсйствия одного и того же фермента на различные субстраты является сопоставление отношений (г.м / Км лля исследуемых реакций. Этот параметр иногда называют коэффициентом специфичности; ои является константой скорости превращения Е + Я в Е + Р При [9[ «Кл) уравнение 6-26 преобразустся к виду с« = — '16<1181 )г,,„ (6-27) Км В данном случае по зависит от концентрации двух реагирующих веществ ([Е<1 и [Я[); следовательно, зто уравнснис описывает скорость реакции второго порядка, и ес константа )г,м / Кл, является константой скорости реакции второго порядка с единицей измерения М 'с '.
Существует верхний предел отношения Й„ / Км, который опрсдсляется скоростью диффузии Е и 6 в водном растворе. Этот диффузионный предел составляет 10к — 10а М 'с ', и многие ферменты характеризуются отношением 7<м</ Км, находящимся в этом диапазоне (табл. 6-6). Про такие фермсцты говорят, что они достигли «катал)ггического совсршепствал. Заметьте, что максимачьное соотношение )гс / Км возможно при самых разных значениях этих параметров. (600 с ')(0.020мкм)(40 мкм) Км + 40 мкМ 9.6 мкмс ' 480мкмгс 9,6 мкмс Км -л 40 л<лМ 480 мкМ'с 9,6 мкМс (Кл< «40мкМ) 480 мкМ« с ' 9,6 мкМ< К,+40« М 50 мкМ 50 л<кМ вЂ” 40 мкМ )О мкМ Км+ 40 мкм Км Км Гг„м(с ') Км(М) )г,муку(М 'с ') 1,4 10< 9-10 ' 1,6.
10« 1. 10« 1,2.10 =. 8,9 Гог 4 10' 26 Гц 1,5 10 4 10< 1,1- 10« 4 10< 5,7 ЦР 2.10 ' 2,8 10« 8 ° 10) 5 ° 10" 1,6-10' ' 9. 102 2,5-10" 3,6 10) 2.0. ЬР 2 10" 1 10« Рго<еги 5<яви<и, р. 166, г<г.г(. Егсе<оао ао<) Соощао«месс '<ог(<. Пле))мсн< ': . ' К)асср«л К<к:тилло:ии<ежт< )и<а ' лжи<школил Ка)кхкш)'и<9)а.я СО 1(СГЬ Ко<о<ока 11зСл< К)<<показ;< .
Крои<пи„ч-Сой с)з) и< р;км' Флзкчьн ."<(аз<а г . 9-7)акга<и<за . Г)<чги)гг))с<и<)««сч<и$ Источник: Естес[а )<. (1999) 5йистиге апг) Месааглгт т Пример б-1 ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТЫ ИИХАЭЛИСА К„ Был исследован фсрмснт, катализирующий сле- дующую химическую реакцию: ГРУСТЬ = ВЕСЕЛЬЕ Исследователи назвали фермент веселазой. Онп обнаружили„что (г,л< для этого фермента составляет 600 с '. Было решено поставить несколько экспериментов.
При [Е,[ = 20 нМ и [ГРУСТЬ[ = 40 л<кМ начальная скорость реакции п„равна 9,6 мкМ . с '. Найдите ю)ачсние Км для субстрата ГРУСТЬ. Решение. Нам известны значения (гсм, [Е,1, [Я и п<л Нужно определить Км. Лучше всего применить уравпенис 6 — 26, а вместо максимальной скорости У „.„подставить Й<«< [Е,[. Подставляя известные нам величины, получаем значение Км.
4,„,1га 1(51 'л = Кл< + 151 б.э Ферментативиая яииетияа яая подход я пониманию механизма действия ферментов [293] Поработав с этим уравнением„вы научитесь легко решать подобные задачи. Например, можно найти значение 1Г„...„, зная, что я„м [Е,] = )гвв» (600 с ' . 0,020 мкМ = 12 мкМ с ' в данном случае).
Если разделить обе части уравнения 6-26 на)г„в», полУчим: 191 Км+ рц Таким образом, отношение т~в/ $~„а„=9,6мкМс '/12мкМс '= = [6!/(К. + [6]) Это упроптает процесс поиска Км, приводя нас к значению 0,25 [5] или 10 мкМ. йййй Пример б-2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ СУБСТРАТА В другом эксперименте по изучению свойств веселазы при концентрации фермента [Е,] = 10 нМ начальная скорость реакции составила 3 мкМ с '. Какой бьша концентрация субстрата [5] в этом эксперименте? Решение. Используя ту же логику, что и в примере 6-1, найдем значение максимальной скорости реакции для данной концентрации фермента. Она составляет 6 мкМ - с '. Обратите внимание, что начальная скорость п„точно соответствует половине К„яс Вспомните, что по определению константа Михаэлиса Км равна концентрации субстрата [5], при которой пв = 1/2 1'„в„.
Таким образом, в этой задаче [5] = Км = 10 мкМ. Если бы значение пр было отличным от 1/2 Р, для нахождения концентрации субстрата следовало бы воспользоватьсяуравнением гь/ тя. = [6]/(Км+ [6]). Многие ферменты каталиэируют реакции с участием двух и большего числа субстратов До сих пор мы говорили о том, как концентрация субстрата влияет на скорость простой фериентативной реакции 6 — Р с единственным субстратом. Однако в большинстве ферментативных реакций с ферментом связываются и претерпевают превращения два или большее число субстратов. Например, в реакции, катализируемой гексокиназой, АТР и глюкоза являются субстратамн, а АОР и глюкоэо-6- фосфат — продуктами: АТР + глюкоза — АОР + глюкозо-6-фосфат Скорости подобных двухсубстратпых реакций также можно анализировать, используя подход Михаэлиса — Ментсн.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
