Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 94
Текст из файла (страница 94)
Как видно из табл. 6-6, гсксокиназа характеризуется разными значениями Км для каждого из субстратов. Фсрмеитативныс реакции с участием двух субстратов обычно идут с переносом атома или функциональной группы с одного субстрата на другой. Такие реакции протекают по одному иэ нескольких известных механизмов. В некоторых случаях в какой-то момент реакции оба субстрата связываются с ферментом, образуя нековалентный тройной комплекс (рис. 6-13, а), причем субстраты могут связываться с ферментом как в определенном порядке, так и случайным образом. В других случаях сначала первый а Неупорядоченное связывание Е ЕБЯя — ч Е+ Рт + Ра ЕБа Упорядоченное связывание Бг Е+ Б, ЕЯ, ~ ЕЯтЯа — > Е+ Рт+ Рз Образование тройного комплекса б Р, Яз Е+ Я, ЕЯ, Е'Р, Е' Е'Яз — ~ Е+ Ра Образования тройного комплекса яе происходит Рис. б-13.
Основные механизмы двухсубстратных ферментативных реакций. а) Фермент и два субстрата образуют тройной комплекс. При упорядоченном связывании сначала должен связаться субстрат 1, а лишь затем происходит продуктивное связывание субстрата 2. При неупорядоченном связывании субстраты могут присоединяться к ферменту в любом порядке.
б) В данном механизме последовательно происходит образование фермент-субстратного комплекса, высвобождение первого продукта, связывание измененной формы фермента со вторым субстратом и высвобождение второго продукта и свободного фермента. Субстрат 1 может переносить на фермент функциональную группу (приводя н ковалентной модификации Š— Е'), которая затем переносится на субстрат 2.
Зто так называемый механизм «пинг-понг», иди механизм двойного замещения. 1294! Часть 1. 6. Ферменты [в1[(мМ) 6 [Бд! (мМ) Рис. 6-14. Анализ двухсубстратных реакций методами стцмвнарной кинетики. Данные графики в двойных обратных координатах (доп. 6-1) атражают серию экспериментов, в которой изменялм концентрацию субстрата 1 прм постоянной концентрации субстрата 2.
Такую серию экспериментов выполнили с разними концентрациями субстрата 2 и получили несколько отдельных линий. а) Пересекающиеся линии указывают на образование тройного комплекса. 6) Параллельные линии указывают на то, что реакция протекает по механизму «пмнг-понг». субстрат превращается в продукт, а лишь затем происходит связывание второго субстрата; тройной комплекс нс образуется. Примером является механизм «пинг-понг» (механизм двойного замещения, рис.
6-13, б). Выявить эти механизмы часто помогает стационарная кинетика (рис. 6-14). Предстационарная кинетика может дать дополнительную информацию о последовательности стадий реакции Мы определили кинетику как основной метод изучения последовательности ферментативной реакции и указали на то, что большинство кинетических параметров не могут пать полной информации о течении реакции. Двумя наиболее важными параметрами, опредсляемыми экспериментально с помощью методов стационарной кинетики, являются величины н„м и й,.„/ Кы. Колебания этих параметров при изменении рН или температуры могут обеспечить ряд дополнительных данных о стадиях реакции.
В случае двухсубстратных реакций стационарная кинетика помогает определить, образуется ли в процессе реакции тройной комплекс (рис. 6-16). Для получения боже полной информации обычно требуется применение сложных кинетических методов, описание которых выходит за рамки данного изложения. Мы лишь кратко представим читателя~ олин из наиболее важных кинетических подходов, использующихся для изучения механизмов реакции, — предстационарную кинетику. Полное описание фсрментативной реакции подразумевает непосредственное измерение скоростей отдельных реакционных стадий, например определенно скорости связывания фермента с субстратом с образованием комплекса Е8.
Скорости многих отдельных стадий реакции могут быть определены независимо в предстациоцарпом состоянии (см. с. 287). Условия реакции подбираются таким образом, чтобы можно было проследить за взаимодействием с одной молекулой субстрата. В связи с тем, что прелстационарная фаза реакции обычно очень коротка, для проведения такого эксперимента требуются специальные приемы, позволяющие очень быстро производить неремешивание реагирующих веществ и отбор проб. Одной из задач подобного эксперимента является определение полной картины энергетических изменений в процессе реакции. Как мы обсуждали ранее, скорость реакции и равновесие реакции связаны с изменением свободной энергии.
Измерение скорости отдельной стадии позволяет понять, как энергия используется специфическим ферментом, что важно лля понимания общего механизма реакции. В ряде случаев удается измерить скорость каждой отдельной стадии многостадийной ферментативной реакции.
Некоторые примеры использования методов предстациоцарной кинетики приведены в равд. 6А. б.З Фериеитативная кииетика как подход к пониманию иеханизма действия ферментов 1295) Ферменты могут подвергаться обратимому и необратимому ингибированию Ингибиторы фсрментов представляют собой соединения, вмешивающиеся в процесс катализа и тем самым замедляющие фермептативныс реакции (вещества, которые ускоряют ферментативные реакции, обычно называют активаторами). Ферменты катализируют практически все клеточные процессы, поэтому неудивительно, что ингибиторы ферментов относятся к наиболее важным фармацевтическим препаратам.
Например, аспирин (ацетилсалициловая кислота) ингибирует фермент, катализирующий первую стадию синтеза простагландинов, участвующих во многих физиологических процессах, в том числе, п возникновении болевых ощущений. Ингибиторы ферментов являются полезным инструментом лля изучения ферментативных механизмов и метаболических путей в клетках. Существует лва основных класса ингибиторов ферментов — обратимые и необратимые. ОЯРЛтИМОЕ ИНГИВИРОВЛНИЕ. Одним из типов обратимого ингибирования является конкурентное ингнбирование (рис.
6-15, а). Конкурентный ингибитор конкурирует с субстратом за связывание в активном центре фермента. Связывание ингибитора (1) с активным центром препятствует связыванию субстрата. Многие конкурентные ингибиторы имеют сходство с субстратом и образуют с ферментом комплекс Е(, который, однако, не может осуществлять катализ. Даже кратковременное связывание такого типа будет снижать эффективность действия фермента. Зная молекулярное строение ипгибитора, имеющего сходство с субстратом, мы можем судить о том, какие участки молекулы субстрата участвуют во взаимодействии с ферментом. Действие конкурентных ингибиторов можно проанализировать методами стационарной кинетики.
В присутствии конкурентного ингибитора уравнение Михаэлиса — Ментен (6-9) примет следующий вид: И„,„(Я) ф (6-28) ПКМ+!Я! где Щ 1Е)(1~ =1+ — к К,= К~ )ЕЦ Уравнение 6-28 отражает важные свойства конкурентного ингибирования.
Экспериментально определяемый параметр и Км, т. е. коне~впту Михаэлиса в присутствии ипгибитора, часто называют кажущейся константой Михаэлиса. кт Е+Я ЕБ — +Е+Р 1 11. Е1 Конкурентное ннгнбироаание б Е+Я ЕБ — эЕ+Р 1 11 ЕЯ1 11 Бесконкурентное кнгнбнрованне В Е+Я ЕЯ вЂ” эЕ+Р 1 1 11 11 Е1+Я ЕЯ1 11 11 Смешанное ингибнрованне Рис. 5-15. Три типа обратимого иигибирования. а) Конкурентный ингибитор связывается в активном центре фериента; связывание ингибитора с ферментом характеризуется константой равновесия (К). б) Бесконкурентный ингибитор связывается вне активного центра фермента, причем связывание происходит только с уже сформировавшимся комплексом ЕЯ.
Связывание ингибитора с комплексом ЕЯ характеризуется константой (К;). в) При смешанном типе ингибирования ингибитор связывается вне активного центрц причем может связываться как с Е, так и с ЕЯ. [296[ Чаоъ1. 6. Ферменты 1 [аКм'1 1 1 гь (У„, / [Б] У 1 1 Км~]1 а' [Ш [Я 16]~А) Поскольку связывание ингибитора происходит обратимо, усилить связывание субстрата можно, если просто повысить его концентрацию. При [Я» [Ц вероятность связывания ингибитора с ферментом уменьшается, и реакция протекает Тип ннгнбирования легко определить, если по экспериментальным данным построить графики в лвойных обратных координатах (доп.
6-1). Проволят лве серии экспериментов с посюянной концентрацией фермента. В первой серии используют также постоянную концентрацию субстрата [6 [, что позволяет измерить влияние роста концентрации ингнбитора [Ц на начальную скоросп и, 1(1) Рис.
1. Конкурентное ингибнрование. 16] (мЬ~ Рис. 2. Бесконкуреитное иигибирование. с нормальным значением У,„. Однако в присутствии ингибитора цри концентрации субстрата, соответствующей па = 1/2 У„., кажугцсеся значение Км возрастает в а раз. Такое изменение константы Михаэлиса при постоянном значении максималь- (не показано). Во второй серии экспериментов полдержнвают постоянное значение [ Ц и варьируют [Я.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
