Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 44
Текст из файла (страница 44)
Функция белка зависит от аминокислотной последовательности Бактерия Езсйеттс1тш сод синтезирует свыше 3000 различных белков, а человек имеет около 25 000 генов, кодирующих етце болыпсс количество белков (гепетические аспекты обсуждаются в части П1 настоягцсй книги). В обоих случаях каждый тип белка характеризуется уникальной трехмерной структурой, необходимой для выполнения определенной функции. Каждый белок, кроме топь имеет уникальную аминокислотную последовательность. Интуиция подсказывает, что именно аминокислотная последовательность должна определять трехмерную структуру белка и, в конечном итоге„его функции.
Но так ли это на самом деле? Беглый обзор многообразия первичных структур белков дает ряд эмпирических доказательств, позволяющих утверждать наличие тесной связи между аминокислотной последовательностью и биологической функцией. Прежде всего, как мы отмечали выше, белки с различными функциями всегда различаются по алтинокислотпой последовательности. Кроме того„тысячи различных генетических заболеваний человека сопровождаются образованием аномальных белков.
Дефекты могут быть различными: от замены одной-единственной аминокислоты (как при серповидноклеточпой анемии, см. гл. 5) до делециц большого участка полипептпдпой цепи (как в большинстве случаев мышечной дистрофии Дюшснна„при которой делеция большого участка гена, кодирующсго белок дистрофии, приводит к синтезу короткого неактивного белка). Теперь мы знаем, что если изменена первичная погледовательность, то и функция белка может измениться. Наконец, при сравнении сходных по функциям белков у организмов, относящихся к разным видам, часто выясняется, что зти белки имеют много общего в аминокислотиых последовательностях.
Например, белок убиквитин, состоящий из 76 аминокислотных остатков, участвует в регуляции дегралации других белков. Было показано, что его последовательность полностью идентична у таких несхожих видов, как фруктовая мушка и человек. Является ли алтинокислотпая последовательность определенного белка абсолютно инвариантной? Ответ такой: пет, возможны некоторые отклонснти. По опенкам, 20 — ЗОЖ белков человека полиморфны, т.
е. в популяции люлей эти белки имеют несколько различающиеся аминокислотные последовательности. Многие из этих вариаций последовательности практически нс оказывают влияния на функционирование белка. Более того, белки со схожими функциями из отдаленно родственных видов могут сильно различаться по размеру и аминокислотной последовательности.
Изменения в некоторых участках аминокислотной последовательности могут не повлиять на функции белка„однако в большинстве белков существуют участки последовательности, особенно важные для их активности, и эти участки консервативны. Доля последовательности, наиболее важной для функционирования различных белков, разная, что усложняет задачу сопоставления первичной и третичной структур, а также структуры и функций. Прежде чем подробнее остановиться на этой проблеме, мы поговорим о том, как определяют аминокислотную последовательность белков.
уже расшифрованы аминокислотные последовательности миллионов белков Два больших открытия, сделанныс в 1953 г., сыграли важнейшую роль в истории биохимии. В 1953 г. Джеймс Д. Уотсон и Фрэнсис Крик создали модель двойной спирали ДНК и предсказали структурный механизм ес репликации (гл. 8). Их предположение раскрыло молеку- 3.4 структура белка: первичная структура !143] лярпыс основы илеи гспа. Тот!!а же Фрслсрик Сснгср определил аыинокислотпук! послслопатсльпоет ь гормона инсулина (рис. 3-24), В-цепь А-цепь С!у Пе Ъа1 1 С!п ! С!и вв Рю 1.ув вв А!а СОО гвс.
3-24. Амииокислотная последовательность инсулина быка. Две полипептидные цепи белка соединены иеиду собой дисупмридными мостиками. Инсулины человека, свиньи, собаки, кролика и кита имеют одинаковые А-цепи, а инсупины коровы, свиньи, собаки, козы и лошади имеют идентичные В-цепи. А1а ! Бег га! Сув Бег ! 1еп С!п 1еп С!п ! Авп Туг (",у:„.-' 1 Авп СОО Ынв РЬе \Ы Авп С!п в Н!в 1еп ! Я"-- В--- Сув С1у Бег ю Н1в 1еп ! Уа1 С!п А1а и 1.еи !лп 1 Ъа! Б — '-; Сув ,г' 6 м С1у С1о Ам С!у ! РЬе РЬе 1 Туг ТЬг удивив многих ученых.
с чптавпшх расчннфропку аминокислотной последовательности полипсптидпой испи осзпадсжпо трудным делом. Скоро с~~~~ понятно, что ну клеотплпая ~~~~~- ловатсльпость ДНК п амипокислотпая последовательно! ть белка какпм-и! образом связаны между собой. Всего через лссять лет посл! этих открытий было установлено, что именно ДНК определяет аминокислотну!о последовательность белка (гл. 27). Сегодня огромное число белковых послсловатсльпостсй можно определить на основании послслопатсг!ьностей ДНК, собранных п пос!т!яцпо расту!цих банках данных. Олпако и соврсмсшшй химии белка чьпто пользуются тралицпонпым методом сскосииропапия белков, поскольку так иногда удастся выявить летали, которые нельзя установить па осповапш! пост!сдоватсльпости гена, такис" как модификации, пропсхоляп!ие после завсрппния синтеза белка.
Химический метод секвенпровапия белка сегодня пополняет все уплипясощийся список новых мстолов, обеспечивающих многочисленпыс пути получения такого рода Лаппых, которые играни важнейшую роль во всех областях биохимических исследований. Короткие полипептиды секвенируют с помощью автоматических секвенаторов Для анализа псрвичной структуры белка примспяк>т различные мс !тзлы. Разработаны мстолики, позволяющие пометить и ил! нтифицпровать М-концевой аминокпглотпый остаток (рис. 3-25, а). Сепгср лля этой цели преллож!сл использовать )-фтор-2,4-липитрсхюпзог!.
Для этой жс цели приФредерик Сентер Полиосптил к,, 1-фтор- 2,4-лииитробензол ю' Х'. О ХО, Йн Свободные 6МНС! Идентификация Х-концевого -СН вЂ” -~ В'-СН + аминоосгатка лолипеотнла. С.-.О СОО НХ 2,4-линитрофепильвос -121 производное Х-концевого С-..О остатка д 2,4-линитро- фенильное производное вентиля н х С-..О Идентификация Х-концевого остатка; очистка укороченного цецтила и повторение с последним реакции Элмама. СГ СООН '.,' н О К' н" ~ Лнилипотиазолино- Фенилтиогилаптионовое производное повоепроизеолоое , Х-концевого остатка Х-концевогоостатка п2 п" Укорочеицыи Нвн — С вЂ” С вЂ” Х вЂ” С вЂ” С.-~ н 1 н н ~( пеотил О О Рис.
3-25. Стадии секвенирования полипептидной цепи. а) Первой стадией секвенирования может быть определение М-концевого аминокислотного остатка. Здесь показана схема определения М-концевого остатка по методу Сенгера. 6) Метод Здмана позволяет определить полную аминокислотную последовательность. В случае коротких пептидов этот метод позволяет полностью определить всю последовательность, и тогда стадию (а) часто пропускают. Стадия (а) полезна в случае больших белков, которые перед секвенированием предварительно разделяют на более мелкие фрагменты (рис.
3-27). сн сн Х ~х-) сн Х вЂ” ( ) — Х=Х-~ " -ВО,С~ ° С ~~---~ )- ЯО,С1 лансилхлорил лабсилхлорил 1! 441 Часть 1. 3. Аминокислоты, пептиды и белки ' у" Фенилизои тиоцианат и -.Г с нх .) 6 '-.- -'-=- - — — (п'-с31 ОН С -=.О ! Сыиз и"-. сн С- О Аллу кт ( мегиют лансилхлорид и лабсилхлорид, производные которых легче детектируются, чем линитрофенильныс производные.
После связывания одного из этих реагентов сХ-концевым остатком осуществляют гидролиз полипептидной цепи (6 М НС() до составляющих ее отдельных аминокислот и определяют меченый остаток Поскольку в результате данной процедуры полипептид разрупшется, этот метод нельзя использовать для определения других остатков, за исключением концевого.
Однако таким образом можно определить число отдельных полипептидных цепей в белке, если все они имеют различные Х-концы. Например, если подвергнуть такой процедуре инсулин, то можно определить два Х-концевых остатка — Рпс и О(у (рис. 3-24). 3.4 Структурабелка:первичная структура [!45[ Чтобы ссквснированать (от англ.
яедиепсе — последовательность) весь белок, обычно применяют метод, предложенный Пером Эдманом. В методе деградации по Эдману удастся отделить от полипсптидной цепи только Х-концевой остаток, не затрагивая все остальные (рис. 3-25, 6). Для этого в слабощелочпых условиях пептид обрабатывают фенилизотиоцианатом, который присоединяется к Х-концевой аминокислоте.
Затем образовавшийся эдлукт отщепляют с помощью безводной трифторуксусной кислоты в виде анилинотиазолинонового производного, экстрагируют органическими растворителями. в водном растворе кислоты прсвращают в более устойчивое фснилтиогидаптионовое производное и идентифицируют. Последоватсльнос проведение реакций сначала в щелочных, а затем в кислых условиях позволяет контролировать ход всего процесса. Все реакции, затрагиваюепие Х-концевой аминокислотный остаток, никак не влияют на остальную аминокислотную последовательность. После удаления и идентификация концевого остатка можно пометить вновь образовиешийся М-концевой остаток, удалить и вновь идентифицировать с помощью той же последовательности реакций.
Эту процедуру повторяют до тех пор, пока не определят все аминокнслотные остатки пептидной цепи. Определение амипокислотпой последовательности по методу Эдмана осуществляют с помощью прибора секвенатора, в котором стадии смешивания реагентов, разделения продуктов, идентификации и записи результатов полностью автоматпзированы. Данный метод необычайно чувствителен. Иногда с его помощью удается определить амипокислотную последовательность белка„имся в руках всего несколько микрограммов образца. Длина полипептидной цепи, которую можно секвенировать по методу Эдмана, зависит от эффективности отлельных химических стадий.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
