Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 43
Текст из файла (страница 43)
50 Первое измерение рг Изозлсктро- фокусирование И Лахсог.кхбхлпп з2 6.9 7,0 10.7 11,0 йсзкм ..~ об ин 31ппсэо~~1е д О из Г1хлк' и зол'и 10гнжрпм с .1ззоцпы, ' -:))7 .И,),::,'),:1 Гель „ после проведения 1 изозлсктро- 1 фокусирования 1 помещают па ',~ полиакрилаыидныи !~ "зьс ЯУЗ ( Умсньше- Второе измерение язв-элсктрофорсз з полиакриламидном гслс пие моле- кулярпых масс Уменьшение р1 мсньшснис алекулярных масс Сложные смеси белков можно разделить, если последовательно использовать изоэлектрофокуснрованис и ЯЕб-электрофорсз с помопгыо так называемого метода двумерного электрофореза (рис. 3-21). Этот метод более чувствителен, чем простой элсктрофорез.
Двумерный элсктрофорсз позволяет разделить белки с одинаковой молекулярной массой, но разными значениями р1 а также бслки с одинаковым значением р7, по с разными молекулярными массами. Возможность контролировать содержание белка в неразделенных смесях В процессе очистки белка необходимо иметь возможность контролировать сто наличие и определять его количество в нсразлелен>юй смеси белков. Но часто приходится осуществаять очистку белка при полном отсутствии информации о его молекулярной массе, физических свойствах и о той доле общей массы белка, которую он составляет.
Если речь идет о ферментах, то их количество в растворе или экстракте ткани люжно измерить или хотя бы оценить на основании их каталитичсской акгивности, т. е. по увеличению скорости преврагцения субстрата в присутствии образца фермента. Для этого нужно зпатгк 1) общее уравнение фермептативной реакции; 2) аналитический метод, позволяющий измерять убыль субстрата или прирост продукта реакции; 3) зависимость активности фермента от каких-либо кофакгоров (ионов металлов) или кофермсптоз; 4) аависимость ферментативпой активности от концентрации субстрата; 5) оптимум рН; 3.3 Как работать с белкаии [1391 ";=-:=~=--,=,-, -,Л: Уменьшение б р1 Рис. 3-23.
Двумерный элеитрофореэ. а) На первом этапе белки разделяют методом иэоэлектрофокусирования в цилиндрическом геле. Затем гель помещают горизонтально на второй гель в виде пластины и подвергают белки разделению с помощью Яб-электрофореза. В горизонтальном направлении белки разделяются в соответствии со значениями рй а в вертикальном направлении — в соответствии со значениями молехулярных масс. б) таким способом удается разделить более 1000 белков, находящихся в клетках Е.
со1й 11401 Часть 1. 3. Аминокислоты, пептиды и белки 6) диапазон тсмпсратуры, в которол1 фермент активен и стабилен. Анализ активности фсрментов обычно проводят при оптимальных для нпх значсниях рН и прн температуре от 25 до 38 'С. Кроме того, обычно берут очень высокие концентрации субстратов, чтобы начальная скорость реакции была пропорциональна концентрации фермента (гл. 6). Активность ферментов принято измерять в международных фсрмснтативпых единицах. В соответствии с международной договоренностью за одну единицу фермептативной активности принимают такое количсство фермента, которое вызывает превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин при 25 'С при оптимальных условиях проведения реакции (лля некоторых фсрмснтов зто определение некорректно, и их активность определяют по-другому).
Под термином активность понимают общее количество сдипип активности фермента в образце. Удельной активностью называют количество единиц ферментативной активности, приходящихся на 1 мг общего белка (рис. 3-22). Удельная активность является мерой чистоты фермента: опа возрастает в пропессс очистки, становится максимальной и больше нс изменяется, когда фермент очищен окончательно (табл. 3-5, с.
136). Рис. 3-22. Активность и удельная активность. Разницу между этими двумя понятиями можно объяснить иа примере двух стаханов с шариками. В стаканах содержится одинаковое количество красных шариков, но различное количество шариков других цветов. Если под шариками подразумевать белки, то л стаканах содержится одина- новая акгпивность белка представленного красными шариками. Однако удельнпп активносщь этого белка ао втором стакане выше, поскольку а кем нраспые шарики состалллют более значительную долю от общего числа шариков. После каждой стадии очистки следует определять фсрмснтативную активность образца (в единицах фермснтативпой активности) и общее количество белка; отношение этих двух значений дает удсльпую активность образца.
Общая активность и общее количсствобслкаобычносппжаются в процессе очистки препарата. Фсрментативная активность снижается, поскольку очистка неминуемо сопряжена с некоторой инактиваписй фермента, например, за счет неблагоприятных взаимодействий с хроматографичсскпми средами или с другими молскулами. Общее количество белка спижапгся, поскольку целью очистки как раз и является удаление максимального количества ненужного пли нсспсцпфического белка.
Стадию очистки можно считать удачной, если после ее проведения потери псспсцифического белка значительно выше потерь активности; таким образом, удельная активность образца возрастает, несмотря на то что общая активность падает. Данные о стадиях очистки образца и их результатах объединяют в таблицы, аналогичные табл. 3-5. Белок считается чистым, если при проведении дальнейшей очистки нс удастся повысить удельную активность, а также если с помощью аналитических методов (напримср, элсктрофореза) детектируется единственная белковая полога. Для белков, нс обладающих фсрментатипной активностью, необходимы другие методы обнаружения. Транспортные белки можно определять по связыванию с транспортируемыми ими молекулами.
а гормоны и токсины — по оказываемому ими биологическому действию. Например, гормоны роста должны стимулировать рост опредслснных клеточных культур. Нскоторые структурные белки представляют настолько значительную фракцию от общего белка клетки или ткани, что их удается довольно легко выделить п очистить без проведения функционального анализа.
Методов решения проблемы в этом смысле существует столько же, сколько и самих белков. Краткое содержание раздела З.З КАК РАБОТАТЬ С БЕЛКАМИ ° Методы очистки и разделения белков основаны на различии их свойств. Белки можно сслективно осадить, добавляя в раствор определенные соли. Супгествусг несколько хромато- 3.4. Структура белка: первичная структура Перанчпая «>>ея <> >ы '~уа! ; Вторичная а-епнраль Лмннокнслнтпая ннелелонательнпгть Чегнертнчнан структура третичная структура Мультигуб>ян<иннчныт< колшлекс Полнпептнлная пень Ркс.
3-23. Уровни вр>аннзацнн белковых молекул. Первичная структура белка представляет собой последовательность аминокислот, связанных между собой пептидными связями к дксуяьфидными мостиками. Образующийся пплипептнд может сворачиваться в определенную вторичную структуру, например в и-спираль. Спираль является частью еретичной структуры молекульс которая, в свою очередь, может быть лишь одной из нескольких субьединиц мупьтисубъединичнпго белка, вместе формирующих его четвертичную структуру (на рисунке изображена структура гемоглобина).
графических методов разделения, с>спованных па разнице молекулярных масс, сродства, заряда и других свойств белков. Из хромап>графических методов чаще всего применяя>т ионообмепнук>, экс>слк>зионну>о, аффинпую и высокоэффективную жилкостную хромато>рафпю. ° Злектрофорстические методы позволяют разделить белки с разной молекулярной массой нлн зарядом.
Методы Я>э-элсктрофореза и нзоэлсктрофокусироваппя можно ис пользовать как по отдельности, так и в сочетании, чтп позволяет получить.чучшсс разрешение. ° Прп <му>цсстнлепии любой процедуры очистки белка необходим мстол паблк>пения за искомь>м белком на фопс всех других белков в смеси. Мсрой очистки белка может быть сто удельная актив>!Ость. Оч ветка белка — это лишь начало летального биохимического анализа его структуры и функций.
Почему олин белок является фсрл>ситом, другой — ! орионом, третий — структурным белком, а 3.4 Структура белка: первичная структура ~ ! 4! ) сщс один — аптитслом? Чем опц принципиально рвзличакгтся с химической точки зрения? Наиболес очсвилные различия проявляются в структуре белков па каждом уровне нх организации. Задача описания и понимания структуры таких крупных макромолскул, как белки, решается на разных уровнях сложности.
Обычно для б>елков вылеляют четыре уровня структурной организации (рис. 3-23). Все ковалснтпыс связи (главным образом псптилпыс связи и лисульфплные мостики), соединякнцие амипокислотпыс остатки в полппсптидпую цепь, прсдставлякп собой первичную структуру осл ка. Наиболее важным элсме>ггом первичной структуры является по<шедопательпость аминокислотных остатков. Вторичной структурой нш>ынают некоторые паиболес часто эстрсчакициеся способы укладки амппокислотной цепи, формирующие характерныс структурпыс >ы>ементы.
Третичная структура описывает все аспекты пространствен>юй организации белка. Если белок состоит пз двух или нескольких полипептилных цепей, их пространственное взаиморасположспиеопигываегся четвертичной структурой. При знакомстве с белками мы рассмотрим даже такис сложпыс бслковыс агрегаты, которые состоят из десятков и даже тысяч субъсдиниц. Первичная структура белка япляс"гся предметом рассмотрения в настоящей 11421 Часть 1. 3. Аминокислоты, пептиды и белки главе; более высокис уровни организации белков обсуждаются в гл.
4. Особенно информативными могут быть различия в первичной структуре. Каждый белок характеризуется определенным числом и последовательностью аминокислотных остатков. Как мы увидим в гл. 4, именно первичная структура белка определяет его трехмерную структуру, которая в свою очередь отвечает за функции белка. В фокусе нашего внимания в данной главе будет первичная структура белка. Прежде всего, мы остановимся на эмпирическом правиле, что ампнокислотная последовательность белка и его функции тесно связаны между собой. Затем мы рассмотрим способы определения аминокислотиой последовательности белка и в завершение поговорим о том, как много информации можно тючерпнуть из первичной структуры белка.