Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 41
Текст из файла (страница 41)
Далее раствор белка можно подвергнуть диализу — процедуре, при которой белки отделяются от других растворенных веществ благодаря своему большому размеру. Частично очищенный экстракт помещают в мешочек пз полупроншщемой мембраны и погружают в большой объем буфера с определенной ионной силой; через мембрану могут проходить соли и компоненты буфера, по не белки. В результате дпализа в мешочке остаются крупные белки„а концентрация солей в мешочке сравнивается с концентрацией в растворе за пределами мембраны. Диализ можно использовать, например, для удаления сульфата аммония из препарата белка. Наиболее мощным методом фракционирования белков является колоночная хроматография, основанная на различии размеров, зарядов, аффинпости и других свойств белков (рис.
3-16). Колонку заполняют твердым пористым материалом (носитель, или стационарная фаза), сквозь который просачивается буферный раствор (подвижная фаза). Раствор белка наносят на всрхшою часть колонки, и он начинал просачиваться сквозь твердук> матрицу как постоянно расширякпцаяся полоса внутри подвижной фазы. Отдельные белки движутся сквозь колонку медленнее или быстрее в зависимости от их свойств. Ионообменная хроматография основана на различии знака н величины заряда белков прп данном значении рН. Носитель„которым заполняют колонку, представляет собой синтетичсский полимер (смолу), содержащий связанные заряженныс группы. Носители с виновными группами называют катионообменниками, а носители с катионными группами — анионообменниками.
Сродство каждого белка к заряженным группам носителя зависит от РН (который определяет состояние ионизации молекулы) и концентрации конкурирующих свободных ионов в растворе. Улучшить разпслепис можно путем постепенного изменения рН и(или) концентрации солей в под- Резервуар с раствором Образец белка (жидквя фвза) Твердый пористый носитель 1~.=-:, Белки А :ф'.в Пористая подложка Злюсит ь С Рис. 3-16. Колоиочиая хроматография.
Стандартная колоиочная хроматография подразумевает наличие твердого пористого материала помещенного в стеклянную или пластиковую колонку. Твердый материал (матрица, или носитель) создает стационарную фазу, сквозь которую протекает жидкость (подвижная фаза). Сверху из резервуара в колонку постоянно поступает раствор, он протекает сквозь колонну и выходит снизу (элюент). Раствор подлежащих разделению белиов наносят в верхиюю часть колонки и дают ему войти в твердую фазу. Дзлее в колонну продолжают добавлять растворитель. Раствор белка образует внутри подвижной фазы полосу, ширина которой сначала равна слою внесенного образца. По мере прохождения через колонку белки начинают удерживаться на носителе за счет разнообразных взаимодействий.
В результате общая полоса белка расширяется. Отдельные типы белков (А, В и С, показанные силин, красным и зеленым цветом) постепенно отделяются лрут от друга, и каждый образует отдельную францию (полосу) внутри общей полосы белка. Чем больше длина колонки, тем лучше разделение, однако полоса каждого отдельного белка со временем также начинает расплываться за счет диффузии, что ухудшает разрешение.
В азнном примере белок А хорошо отделился от белков В и С ио из-за диффузии полное разделение В и С в данных условиях не представляется возможным. 3.3 Как работать с белками 1133] нижной фазе, т.с. путем создания градиента рП нли концентрации соли. При катионообменной хроматографии (рис. 3-17, а) стационарная фаза имеет отрицательно заряженные группы. Белок, несущий суммарный положительный заряд, лвижстся в жидкой фазе мслленнсс, чем белок, несущий отрицательны заряд, поскольку пролвижсние первого белка тормозится за счет взаимодействия с носителем.
Расширение полосы белка в подвижной фазе объясняется как разлелением белков с различными свойствами, так и диффузной. По мере уасличепия длины колонки вероятность разделения двух белков с различными зарядами обычно возрастает, однако время разделения увеличивается. В результате разлелснпс полос может лаже ухудшиться, поскольку с увеличением длптсльностп процесса преобладающий аффект оказывает диффузия. По мере выхода раствора с колонки фракции элюснта собирают в отдельные пробирки. Затем каждую фракцию тестируют на присутствие иском<то белка и других белков. Все фракции, в которых содержится искомый белок, можно объединить. ~ ПримерЗ-1 РАЗДЕЛЕНИЕ ПЕПТИДОВ С ПОМОЩЬЮ ИОНООБМЕННОИ ХРОМАТОГРАФИИ Биохимик хочет разделить два псптида с помощью ионообмспной хроматографии.
При том значении РН, при котором происходит разделспис на колонке, пептид А имеет суммарный заряд — 3, поскольку в его последовательности чаще встречаются остатки С!и и Азр, чем Агп, Пуз и Н(з. Псптид В имеет суммарный заряд +1. Какой псптил будет первым сходить с колонки, заполненной катионообмсгщой смолой? Какой псптид будет первым сходить с колонки, заполненной аниопообмснной смолой? Решение. Катионообменная смола имеет на поверхности отрицательно заряжеппыс группы н связываст положительно заряженныс молекулы, замедляя их перемещение вдоль колонки.
Пептнд В, несущий положительный заряд, сильнее связывается с катионообмснной смолой, чем пептид А, так что псптид А сходит с колонки первым. В случае анионообмснной смолы первым будет выходить псптид В. 'Убавь)згвмз 1 ф!~,' 1 23456 1 234 56 1 ф Искомый белок ф' раствор ..'д, лиганла 1134] Чапь Д 3. Аиинонислоты, пептиды и белки полимерные шарики с отрицательно заряженными У 7 функциональными труппами Ь Смесь бгшков наносят на колонку с катионообменником Скорость прохождения белков сквозь колонку зависит от их заряда и значения рИ.
В случае катионообменной хроматографии быстрее всего сходят с колонки белки с максимальным суммарным отрицательным зарядом. Ионообменная хроматография Рис. 3-17. Три хроматографических метода, применяемые при разделении белков. а) Ионообменная хроматография использует разницу в знаке и величине заряда белковых молекул при определенном значении рН. б) Эксклюзионнзя хроматография (гель-фиаьтрация) позволяет разделить белки разного размера.
а) Аффинная хроматография позволяет разделять белки в соответствии с их способностью связываться со специфическим носителем. Дальнейшее объяснение зтих методов дано в тексте. пористые полимерные Смесь белков наносят г '-'т"";: на колонку с перекрестие-,"-:~"-~. сшитым полимером. 34олскулы белков разделяются в соответствии с их рачмерамн: более крупныс молекулы движутся и сходят с колонки быстрее, чем более мелкие. Эксклюзнонная хроматография 1Ф Счг т л Смесь белков наносят . Ф на колонку, содержащую ', '. ! связанныйснолимерным ';. 3 ' млг и носителем специфический -''.' ф >~ ' иь: 4,13.
ли санд. 12345 345578 Балластные белки ~ Искомый белок злюнсходят с колонки. руют раствором лиганШ. Аффинная хроматография 3.3 Как работать с белками ~1351 Псптил А, несущий отрицательный заряд, залерживастся за счет взаимодействия с положительно заряженными группами носителя. На рис. 3-17, кроме того, представлены два лругих типа колоночной хроматографии. Эксклюзиоиная хроматография (также называемая сиговой хроматографией или гель- фильтрацией; рис. 3-17, б) позволяет разделить белки разного размера. В этом методе более крупныс белки сходят с колонки бьютрсе мелких белков, что па первый взгляд противоречит интуитивным соображениям. Дело в том, что твердая фаза колонки состоит из шариков с порами или полостями определенного размера.
Крупные белки нс гиогут проникать в поры п поэтому просто проходят между шариками. Мелкие белки попадают в поры, задерживаются там, и в результате движутся сквозь колонку медленнее. Аффинная хроматография основана на способности белков связываться с носителем (рнс. 3-17, в).
Шарики в колонке на своей поверхности несут присоединенные ковалентпой связью химические группы, называемые лиганлами; лигацд — это химическая группа или молекула, связывающаяся с макромолекулой (например, с белком). Ири нанесении ца колонку смеси белков каждый белок, пмекпций сродство к этому лиганду, связывается с шариками; в результате его пролвиженис вдоль колонки замедляется. Например, если биологическая функция белка полразумсвает его связывание с АТР то связывание АТР с шариками позволит создать аффинную матрицу, которую можно использовать для очистки этого белка. При прохождении раствора белка вдоль колонки все АТР-связывающие белки (включая искомый белок) связываются с матрицей.
Когда все не связываюгцисся с матрицей белки схолят с колонки, связавшиеся белки смывают раствором, содержащим либо высокую концентрацию соли, либо свободный лиганд (в данном случае АТР). Соль ослабляет связывание белка с иммобилизованным лигандом, нарушая ионные взаимодействия. Своболный лиганд конкурирует с иммобилизованным лигандом за связывание с белком, что приводит к снятию белка с матрицы.
Однако в дашюм случае сходящий с колонки белок часто связан с лигацдом, применявшимся для элюировапия. Наиболее усовершенствованным хроматографическим лштодом является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ или НР$Х, от англ. й(йй-рег7оппинсе Щий сйготагойгар1ту). В данном методе для ускорения движения белковых молекул через колонку используют насосы, создающие высокое давление. Кроме того, применяют специально разработанные высококачественные хроматографические материалы, способные выдерживать условия высокого давления.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
