Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 45
Текст из файла (страница 45)
Представьте себе белок, па М-конце которого расположена последовательность О!у-рго-1.уз и т.д. Если глицин был удален с эффективностью 97;4, это означает, что 34 полипептидных молекул в растворе по-прежнему имеют на Х-копцс остаток глицина. Во втором цикле пролип составляет 94;4 свободных аминокислот (9714 остатков Рго отщепляются от 97Ж молекул, за- канчивающихся на Рго), а глицин составляет 2,9",4 (974 остатков О[у отщепляются от 3;4 молекул, заканчивающихся на О1у), а 34 молекул сохранят на Х-конце глнцип (0,114) или пролив (2,94). И так в каждом цикле те псптиды, которые пе отщепились на предыдущей стадии, будут вносить все более и более возрастающую погрешность; в конечном итоге станет невозможно определить, какая же аминокислота находится в настоящий момент па конце цепи. В совремснпых секвенаторах достигается эффективность, превышающая 99У4 за цикт, так что с пх помощью можно определить последовательность из 50 и более остатков.
Первичную структуру инсулина, пад которой Сентер с сотрудниками трудились более 10 лет, сегодня можно определить за 1 — 2 дня прямым ссквенированием в белковом ссквенаторс. (Как мы будем обсуждать в гл. 8, секвепирование ДНК лаже более эффективно.) Крупные белки перед секвенированием необходимо разделить на фрагменты По мере увеличения длины полипептида число ошибок в определении аминокислотной последовательности обычно возрастает. Для определения последовательностей больших полипсптидов и белков их необходимо разделить па более мел кис фрагменты, а затем каждый секвснировать отдельно. Данный процесс включает в себя несколько стадий.
Сначала белок расщепляют на специфические фрагменты с помощью химических или фсрментативных методов. Если в белке существуют дисульфидные связи, их следует разрушить. Каждый фрагмент выделяют из смеси и ссквенируют по методу Элмана. В заключение определяют порядок расположения фрагментов в исходной цепи и локализацию дисульфидных связей, если они есть. Разрыв дисульфидных связей.
Наличие лис ул ьфидных связей мешает определению аминокислотпой последовательности. Остаток цистеина (рис. 3-7), отщспленный от полицептидной цепи в реакции Эдмана, может остаться связанным с другой полипептидной цепью дисульфилным мостиком. Кроме того, дисульфидпыс мостики мешают ферментативному и химическому расщеплению полипептидной цепи на фрагменты. дисульфицный мостик Хн О О О=С ! !! !! НС вЂ” СН,— Я вЂ” ΠΠ— Я вЂ” СН,— СН !! !! С=О О О НМ Остатки цисгеиновой О=С ! НЯ вЂ” СН,— СН ! МН ! НС вЂ” СН вЂ” ЯН ! С=О ! Ацстилкровакие иолацетатом кислоты О=С ! ООС СНл Я СН СН ! НХ ! НС вЂ” С На — Я вЂ” СНл — СОО ! С=О Ацетилироваццые остатки цистекпа Рис.
3-26. Расщепление дисульфидимх мостиков в белках двумя известными методами. В результате окисления остатков цистеииа пад действием иадмуравьиной кислоты образуютсл остатки цистеииовой кислоты. После восстановления дитиотрейтолом или р-меркштгозтаиолом с образованием двух остатков цисгеина необходимо провести дальнейшую модификацию реакционноспособиых -БН групп, чтобы предотвратить появление нового дисупьфидиого мостика. Для этой цели используют ацетилироваиие с помощью иодацетата. 11бб) Часть 1. 3. Аминокислоты, пептиды и белки На рис. 3-26 схематично изображены два способа необратимого расщепления дисульфидных связей. Расщепление полипептидной цепи.
Существует несколько методов разделения полипептидной цепи на фрагменты. Гидролиз псптидных связей катализируют ферменты протеазы. Некоторые протсазы специфически расщеггляют только тс пептидиые связи, которые связывают определенные аминокислотныс остатки (табл. 3-7). С помощью таких протеаз можно воспроизводимо получать предсказуемые фрагменты. Некоторые химические реагенты также способны расщеплять пептидную связь между определенными аминокислотами.
Пищеварительный ферменттрипсин, относящийся к классу протеаз, катализирует гидролиз толь- ко тех псптилных связей, карбонильпая группа которых принадлежит остатку лизина или арпгнина, вне зависимости от длины полипептилной цепи. Таким образом, зная общее число остатков Еуз и Агд в полипептидной цепи, определенное из реакции полного гидролиза образца (рис. 3-27), можно предсказать число фрагментов, на которые расщспится полипептидная цепь при обра1ютке трипсином. Полипептид, имеющий в последовательности пять остатков 1.уз и (или) Агя, в результате действия трипсина должен расщепиться на шесть фрагментов.
Каждый из этих фрагментов, за исключением одного, будет иметь па С-конце остаток 1.уз или Агя. Фрагменты, полученные в результате расщепления трипсииои, другим ферментом или химическим рсагентои, далее подвергают очистке хроматографическим или электрофоретическим методом. Учаспж расщепления'* йй66.' рв (6иоло, В ) е Трипсин (поджелудочная быка) Протеаза из подчелюстной железы (мышь) Химотрипсин (поджелудочная быка) Протеаза Ч8 (бактерия 5азрЬу(ососсиз аигеиз) Азр-Х-протеаза (бактерия Ргеийплопаз ЯаЯ Пенсии (желудок свиньи) Эндопротеиназа Еуз С (бактерия йуяобасгегвтутоявлеа) Бромциан ЕУ,А я(С) Агя (С) Рйе, Тгр, Тут (С) Аар, О!о (С) Аар, С!о (Х) (ло, Рое, Тгр, Туг (Х) Пуз (С) Мес (С) ' Бсе рсагситы, за исключением бромниана, являются протсазаии; вес доступны из коммср- чсскик источников. "* Указанные амииокислотпыс остатки являкжся участками узнавания фермента или рса- гепта, которые расшспликгг псптиднук> связь па С- или Х-стороне указанного остатка.
Секвенирование пептидов. Каждый фрагмент, полученный в результате распгепления трипсином, секвен ируют отдельно по методу Эдмана. Определение порядка расположения фрагментов в исходном полипептиде. На данном этапе необходимо определить порядок расположения <трипсиновых фрагментов». Для этого образец исходного полипептида подвергают расщеплению еп4е одним ферментом или реагентом, который расщепляет пептидные связи между другими аминокислотнымн остатками, чем трнпсин.
Например, можно использовать бромциан, расшепляющий только те пептидпыс связи, карбопильная группа которых приналлежит остатку метионина. Получсгшыс н результате расщепления фрагменты вновь очищают и секвенируют. Затем необходимо исследовать ампнокислотныс последовательности всех имеющихся фрагментов с целью найти такис фрагменты, полученные в результате второго расгцеплення, которые перекрывали бы разрывы между фрагментами, полученными в первом эксперименте (рис. 3-27). Аминокислотпан последовательность этих перекрывающихся псптидных участков позволяет установить порядок фрагиентон, полученных в первом расщеплении. Если перед проведением первого расщепления была определена аминокислота, находящаяся 3.4 Структура белка: первичная структура [147[ на Х-коцце полипептида, то с помощью этой информации можно найти фрагмент, прилегающий к Х-концу. Кроме того, сравнивая два набора фрагментов, можно найти возможные ошибки в определении аминокислотной последовательности.
Ингида второго расщепления полипсптида на фрагменты оказывается недсютаточно, чтобы найти перскрывакпциеся последовательности некоторых фрагментов. В этом случае применяют третий, а то и четвертый способ расщепления, что позволяет и итоге получить полный набор перекрывающихся последовательностей исходной цепи. Локализация дисульфидных связей. Расположение дисульфидных связей в исходной молекуле определяют после завершения ссквенировапия последователыюсти.
Для этого исходный полипептид вновь подвергают расщеплению, например трипсином, на этот раз без предварительного разрушения дисульфидных связей. Образующиеся фрагменты разделяют методом элекгрофорсза и сравнивают с набором фрагментов, полученных при первом расщеплении трипсипом.
Если между двумя фрагментами существует дисульфпдная связь, то эти фрагмегггы отсутствуют в новом наборе фрагментов, зато там появляется более тяжелый фрагмент. Два отсутствующих пептида соответствуют участкам исходной полипентидной цепи, между которыми существует дисульфидная связь. Выводы Процедура Результат Н2 К1 1 3 Я 2 К 2 Т 1 Ь 2 Ч 1 М2 У2 Р 3 гилрелла; ркалелелле аиилокиелет Полипсптил мом: Х-концевым остатком является Е (С!ц) олределеиие 2,4-динитрофеиилгтутамата О' О Т2 ЕСААУНВРЕР1ВРК ® ДТ4 71.1АССгРМТК Т2 расположен иа !Ч-конце, Я поскольку начинается с Е (Г1н).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
