Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 47
Текст из файла (страница 47)
На рисунке они обозначены как ионы Ь-типа и у-типа в зависимости от того, остался заряд на С- или на М-конце фрагмента. б) Типичный спектр, полученный при обработке пептида состоящего из 10 аминокислотных остатков. Помеченные пики соответствуют ионам у-типа. Самый высокий пик (соседний с пиком у,") соответствует иону с двойным зарядом и не относится к данном серии. Пики отличаются друг от друга на одну аминокислоту, стоящую рядом в пептидной цепи. В данном случае получена пептидная последовательность Р)>е-Рго-6<у-6<п-(Пе/1ец)-Аэп-А<а-Аэр-(Пе/1ец)- Агд. Заметьте, что существует неопределенность в идентификации лейцина и изолейцина, имеющих одинаковую молекулярную массу.
В нашем примере серия пиков, относящихся к у-типу ионов, является преобладающей, что сильно облегчает расшифровку спектра. Зто связано с тем, что на С-конце пептида расположен остаток Агд, на котором сосредоточена большая часть положительного заряда. Я<эти известна пуклсотпдиая последовательность гена, то лля олиашачноп> <люп<есеппя гспа с белком ооычно лостап>чно прочесть ли>пь короткий фрагмент амииокислотпой послсловатеэ>эпос<и. Ссквспироваш<е с почошью л<асс-спектрометрпи пе может заменить секвснировапия длинных фрагментов по лютолу Ээ<л<ана, по .лот метал идеально полхолит л;ш исследований в обла- сти протеол<ики, направленных на каталогизацию сотен клеточных белков, которые можно разделить методом двумерного электрофорсэа.
в процессе фрагментации в камере соударений в местах разрыва не образуется обычных карбоксильпых яли амииогрупп. Единственными полноценными а-амина- и а-карбокспльцыми группал>и являются группы, расположенные на самых концах фрагментов (рис. 2, а). В связи с этим, лва набора фрагментов имеют нсбольшис различия в молекулярных массах.
Определение амипокислотпой послсловательпости ко двум наборам фрагментов повышает точность резул ьз'ата. ~зоо о Х Яо 75 Ф 50 ч 25 я Ы О О 3.4 Структура белка: первичная структура [151[ 1152! Часть 1. 3. Яиинокислоты, пептиды и белки генетического кода (гл. 27) и появлением методов идентификации генов (гл. 9) стало возможным определять аминокислотную последовательность полипептида на основании пуклеотидной последовательности кодируюшего его гена (рис. 3-28).
Методы определения последовательностей ДНК и белка дополняют дру> друга. Дпя белка, ген которого доступен, секвепировацие ДНК люжет дать более быстрые и зочпыс результаты, чем секвепировапие салюго белка. Аминокислотные последовательности большинства белков теперь определяют именно таким косвенным методом. Если геп пс выделен, то необходимо проводить секвснированпе белка, причем полученный результат дает больше информации, чем анализ последовательности ДНК, который, например, ничего не говорит о расположении в молекуле дисульфилных связей. Кроме того„знание аминокислотной последовательности лаже небольшого участка полипептидной цепи может в значительной степени облегчить выделение соответствующего гена (гл.
9). Существующие сегодня методы анализа белков и нуклеиновых кислот дачи возможность для развития новой дисциплины — «биохимия целых клеток». Теперь можно изучать послеловательпости всей ДНК (генома) самых разных организмов — от вирусов и бактерий до много- клеточных организмов (табл. 1-2). Новые гены открывают тысячами, причем часть из них кодирует белки с пока неизвестными функциями. Для описания всего комплекса белков, копируемых в геноме организма, ученые предложили использовать термин «протеом». Как будет обсуждаться далее в гл.
9, новыс дисциплины протеомика и геномпка — зто взаимодополняющие разделы исследований в области клеточного метаболизма и метаболизма нуклсиновгях кислот, направленные па создание нсе более полной картины биохимии клеток и целых организмов. Амннпкнслптнвя последовательность (белок) С!п-Т>т — Рпг — Г>гг — Пе-Тгр сАстАтсстАссАтттсГ Послелпввтельпогть ЛНК (ген) Рис.
3-28. Соответствие последовательностей ДНК и аминокислот. Каждая аминокислота кодируется специфической последовательностью трех нуклеотндов в цепочке ДНК. Подробно о генетическом коде си. гл. 27. Небольшие пептиды и белки можно синтезировать химическим путем Многие пептиды используются в фармакологии, позтому их синтез имеет определенный коммерческий интерес. Есть три способа, с помощью которых можно получить пептил: 1) выделить пз ткани, что часто затруднено его крайне низкой концецтрациеп; 2) получить гсппо-цпженерныи путем (гл. 9); 3) синтезировать химическим путем.
Во многих случаях метолы прямого химического синтеза являются предпочтительными. Кроме коммерческого приложения химический синтез используется для созланпя специфических пептидных фрагментов, необходимых лля изучения структуры и функций белков. Традиционныс методы синтеза органических соединений не годятся Лля получения пептидов н белков, имеющих н цепочке более 4 — 5 аминокнслотных остатков, что сяязапо с особой сложностью белковых структур. Одна из возникающих на атом пути проблем состоит в очистке продукта после сто синтеза. Большой вклад в развитие методов гинтс>а пептидов был сделан Робертом Брюсом Меррпфилдом в 1962 >; Он предложил синтезировать пептих, Роберт Брюс Иеррифил1ь 1921 — 2008 закрепив один его к<>нец на твердой подложке.
В качестве подложки можно использонать нераспюримый полимер (смолу), яомс>ценный в колонку, похожую па те, что используются в хролгатографии. К закрепленному на подложке пептпду с помощью стандартного нагюра реакций пришивают по олной аминокислоте, а затем повп>ряя цикл с другой аминокислотой (рис. 3-29).
На кажлой стадии цикла используют защитные химические группы, предгпвращающие побочные реакции. Теперь технология химического пс>ггидною синтеза антоматизирована. Анаюгично реакциям ссквснирования, данный процесс ограничивается 3.4 Струк!ура белка: первичная структура [153) Нсрастнорнмые полнстнреновые шарики РМОС С! СН Аминокислота 1с п-амипогруппой, защищенной РМОС 11рик!ю!ьтение С-конаеной аминокислоты к рсакпнои- !ккпособной груяпе носителя 1:МОС 1 ГМОС . -Х вЂ” СН--С О-.СН К' О 1 Х--.СН- С--О Н К' О Аминокислота 2 с нагни пгеннпй и-амино- НтХ -СН С вЂ” 'О СН о 3 групппй активируется «арбоксильной ру й ДКК. Х=С=Х Дипиклогсксилкарболиим (ДНК) ,а ! О ! !! ! Х вЂ” С вЂ” Х Н Н Ка О .'К' О защитную ~руину с готоаого о Б пептида спимактг в сгютвстствии с рсакнисй(2); Нррасшенляег афирную связь между псптндом и подложкой.
Ка О К''О й НхХ-.СН вЂ” С- — Х-.СН--(.; — О' + Р СНа 'Н Рис. 3-29. Химический синтез пептида на твердой подложке. Для образования каждой пептидной связи необходимо осуществление реакций 1-4. Защитная флуоренилметоксикарбонилъная группа (ЕМОС, выделена синим цветом) предотвращает побочные реакции по а-аминогруппе аминокислотного остатка (выделены красным цветом). Химический синтез протекает в направлении от С-конца к Х-концу пептидной цепи, т. е. в противоположном направлении по сравнению с синтезом !л у(уо (гл. 2?). О К' О Амннокислотный остаток Защитная группа удалит!се ! слабым растнором орп!нинеского осноаани». ! ! ! ! ! Аминогрупаааминокислоты 1 такует актианрошншую «арбок- ! льиую группу аминокиглоты 2:! ралуетсипептидная свиаь.
! Дипнклогексилмочепнна, (побочный продукт) 1!рн необходимое!и о-о нонторню! ш — — — — — — — — — — — —- 1154 ) Чапь 1. 3. Аиииокислоты, пептиды и белки Обжил выход тесового продукта (Ж) в аааисмчости Число остатков от выхода па памдов стадии в помечаем подвпептнде 99,99ь 99,9% 11 21 31 51 100 66 29 13 1,8 98 96 94 90 82 Аминокислотная последовательность служит источником важной биохимической информации Знание аминокислотной последовательности белка позволяет понять его трехмерную струк- эффективностью каждого отдельного реакционного цикла (это можно понять, рассчитав сумл1арную эффективность процесса, каждая стадия которого идет с выходом 96,0 или 99,8% (табл. 3-8)). Неполное провсдеште реакции на одной стадии приводит на следующей стадии к образованию примеси (более короткого пептида).
Усовершенствование химических методов позволило с хорошим выхолом синтезировать белки, сосгоящис из 100 аминокислот, всего за несколько дней. Очень близкий подход используется для синтеза нуклеиновых кислот (рис. 8-35). И все жс методы лабораторного синтеза по-прежнему ничто по сравнению с биосинтезом в живых организмах! В бактериальной клетке такой же белок из 100 аминокислот синтезируется с высочайшей точностью приблизительно эа пять секунд. Новые эффективные методы лигировапия (сшивания) отдельных псптидных фрагментов позволяют собирать из синтетических пептидов более крупные белки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
