Главная » Просмотр файлов » Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1

Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 46

Файл №1123313 Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (Д. Нельсон, М. Кокс - Основы биохимии Ленинджера в 3-х томах) 46 страницаOsnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313) страница 462019-05-10СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 46)

Тфрагположеп па С-конце, 0 поскольку не заканчивается на К(Лгд) или К (! уз). Б-1 ЕСААУНВГЕР1ВКРСЛЯМОЗ)перекрыиасгся сСТП!) и СТ4), О С) поэтому можно опрелел ить Б-2 ТКВСЧНЕВ их порядок. ОБ-3 АМКЬУ!АССРМ Ст.2) Ст.1! 04 Отз ЕСААЧНВРЕР!ВРНСАБМАЬ!КТЫАСПРМТКВСЧНБВ С-конец ОБ-з СБ-2) Рис. 3-27. Расщепление и секвеиирование пептидов и определение порядка расположения пептидных фрагментов. В первую очередь определяют аминокислотный состав и Н-концевую аминокислоту в исходном пептиде. Затем разрушают все имеющиеся в молекуле дисульфидные связи, мешающие секвенированию.

В данном полипептиде есть только два остатка цистеина (С) и, оютветственно, только одно возможное место локализации дисульфидной связи. В палипептидах с тремя и большим числом остатков цистеина расположение дисульфидных мостиков определяют так. как зто описано в тексте. Расшифровку однобуквенных и трехбуквенных обозначении аминокислот см. в табл. 3-1. Аминокислотную последовательность можно вывести на основании других данных Описанный выше метод не является единственным способомдляустановленияаминокислотнойпосле- довательности. Новые масс-спектрометрическне методы позволяют определять последовательности коротких пептидов (20-30 аминокнслотных остатков) всего за несколько минут (доп.

3-2). Кроме того, с развитием быстрых методов ссквенирования ДНК (!ш. 8), установлением 1143] Чапь 1. 3. Аминокислоты, пептиди и белки А 5 С 2 В 4 Е 2 Р 1 П 3 Полипептид состоит иэ 33 амипо- кислотных остатков. Существуют три участка распгспления трипсином: даа у остатка К (Ьуз) и один у К (Агд), т. е. при ращцеплепии будет получено четыре фрагмепть, Вромциан расщепляет последова- тельность у двух остатков М (Ме!) с образованием трех фрагмептон.

3.4 Структура белка: первичная структура [149! Масс-гпекгрометр является одшв< из важнейших приваров дтя химических исследований. Лпализируемыс молекулы (аналнты) сначала ионизируют в вакууме. Затем вновь образовавшиеся заряжеииыс частицы вводят в электрическое и(или) л<агпитнос поле, причел< их движение в поле зависит от отношения их массы к заряду (т/г).

Эта измеряемая величина может Г>ыть исполь:юваиа лля определения молекулярной массы (М) авзлита г высокой точностью. Масс-спектромстрия используется в качестве метода ана>иза уже долгие п>ды, по до относительно недавнею времени ие было возможности использовать этот метод лля изучения макромолскул, таких как белки и иуклеиповые кислоты. Дело в том, что измеревис отношения и/г осуществляется в газовой фазе, а вагревание или другая процедура, необходимая для перевода вещества в >ж>ообразпос состояние, обычно елече> за собой еп> разрушение.

В 1988 г. были и редл- ожси два подхода, поз вол и в и ше решить эту проблему. Водном методе белок >юмсшают в светоиоглощаю>ную матрицу Под действием пульсирующего лазерно > о излученияя белки в матрице ионизируются и выхолят из матрицы в вакуумнук> кал<еру. Этот метод, известный как лазерная десорбционно-ионизационная массспектрометрия (МАЕ1)1), успешно используется для определения молекулярных лисс <иирокого круга макромолекул. Во втором успешно примсцякяцемся методе макромолекулы переходят в газовую фазу пряли> ит раствора. Раствор а налита пропускают через раси ылитсльиук> головку, находя>цуюся в силыюм электрическом и< де, в результате чего раствор превращается в мельчайшие заряженные капельки.

Растворитель мгновенно испаряется, а заряжепныс макромолекулы а неповрежденном ниде оказываются в газовой фазе. Данный метал носит название электроспрея (Е$1- масс-спектрометрии). Протоны, присоединявшиеся к чакромолскулал< в процессе п)к>хождения через рагвнлитсльнос устройство, сообщают им дополнительный зарял. Значение параметра т/г опрелеляют в вакуул<иой камере. Масс-спектрометрия позволяет получить Гюльшое количество информации, необходимой для исслсдоваяий в облаем< протсомики, энзимолоп<и и химии Г>елка в целом. Для проведения экспериментов требуются минимальные количества образцов: достаточное количество белка для анализа можно получить, например, методом двумерного ш>ектрофореза.

Точное опредс- Г Масс- спектрометр Стеклянный капилляр Раствор образца Г Высок<к напряжение Вакуум 47 342 Рис. 1. Метод злектроспрея для определения молекулярной массы белка. а) Раствор белка распыляют в виде сильнозаряженных мельчайших капеле>ь пропуская через распыляющую головну, помещенную в сильное электрическое поле.

Растворитель испаряется, а ионы аналита (в данном случае с присоединенными протонами) подаются в масс-спектрометр для определения отношения ш/г. б) Полученный спектр представляет собой набор пиков, каждый из которых отличается от предыдущего (справа налево) увеличением массы и заряда на одну единицу. На вставке показан результат компьютерной обработки данного спектра. ление молекулярной массы белка — это один из кпочевых моментов ири его идентификации. Если масса белка известна, то метод масс-сиектрометрии позволяет дсгсктировать все изменения, происходящие при связывании кофакторов, ионов металла, при ковалсцтных модификациях белка и т. д.

На рис. 1 приведен пример определения молекулярной массы белка с помо>пью мепща злектроспрея. 100 $75 Й 25 О 0 600 1 000 1 200 1 400 1 600 11501 Часть 1. 3. Аминокислоты, пептиды и белки ?1ри переходе в газовук> фазу белок приобретает какосто количество протонов (т. е. положительных зарядов) от молекул растворителя. В результате образуется спектр частиц с различным отношением массы к заряду Каждый регистрируемый пик соответствует отдельному типу частиц, отличающсл>уся от соссднсп> на единицу заряда н единицу массы (на 1 протон). Молекулярную массу белка можно рассчитать по любым двум соседним пикам. Для одного пика: Мэи>Х (ш/г)т = пг где М вЂ” молекулярная масса белка, и, — число зарядов, Х вЂ” молекулярная масса добавленной группы (в лаипом случае протона).

Аналогично, для соседнего пика: М+ (пг + 1)Х (ш/г)> = Теперь у нас есть два неизвестных (М и и,) и два уравненияия, так что можем их решить сначала относительно иэ а затем относительно М; (и/а)з — Х и> = (ш/з» - ( ' ) М = и>1(~/з), — Х) Такой способ вычислений па основании значений и/а для любых двух пиков пз спектра (рис. 1, б) обычно позволяет найти массу белка с ошибкой, не прсвыша>ошей 0,01Ж (в данном случае анализировали белок аэролизин )г с М = 47 342).

Использование нескольких серий пиков, повторные вычисления и усреднение результатов могут еще более повысить точность определения молекулярной массы М. Компьютсрныс программы позволяя>т получить точный результат по значению и/з для одного пика (рис. 1, б, встанка). Масс-спектрометрия является бесценным инструментом, с помощью которого ьюжпо быстро определить короткук> аминокислотнук> последовательность неизвестного осака. Данный метод называется тандемной масс-спектрометрией.

Сначала раствор исследуемого белка обрабатывают протсазой или хиь>ичсскил> реагентом, чтобы получить смесь более коротких пептидов. Затем эту смесь подают в устройство, представляю>дсе собой два последовательно расположенных масс-спектрометра (рис. 2, и, веерху). В первом масс-спектромстре сл>есь ионизованпых пептидов сортирустся таким образом, ч'тобы только один тип фрагментов, полученных прп расщеплении, мог достичь слслух>шеи> отсека.

Этот образец, каждая молекула которого имеет определенный заряд, проходит через вакуумнук> камеру между двумя масс-снсктрометрами. В этой так называемой «камере соударений» псптил разрушается на еще более мелкие части под действием активных соударений с молекула>ш ипертноп> газа (аргона или гелия), подаваемоп> в камеру. Процесс проводится в таких условиях. чтобы кажлый отдельный псптидный фрагмент был разлелен в среднем не более чем на две части. Боль>пипство разрывов приходится на пептидные связи.

В данной реакции молекулы воды нс участвуют, так как все происхолит в вакуумной камере, поэтому среди продуктов реакции встречаются радикалы, например карбонильныс радикалы (рнс. 2, и). Заряд. находившийся на исходном фрагменте, теперь сосрслоточен на одной из его частей. Во втором л>асс-спектрометре происходит измерение отношений и/а всех заряженных фрагментов (пеааряжснные частицы нс регистрируются). В результате получают одну или несколько серий пиков. Данная серия пиков (рис.

2, 6) отражает наличие всех заряженных фрагментов, которые образовались при разрыве одного и того же тина связи (по в разных частях полипсптидной молекулы) с одной и той же стороны связи ()Ч или С). Соседние пики в одной серии различая>тся на одну аминокислоту. По разнице молекулярных масс соотвстствукнцих пиков можно определить, какая именно аминокислота стоит следующей в полипсптидной цепи. Сложность возникает только с идентификацией лсйцина и изолейцина, поскольку они имеют одинаковыс молекулярные массы. При разрушении пептида заряд может сохраняться как на >Ч-к>и>цевом, >ак и на С-концевом фрагменте, кроме того, возможен распад молекулы не по псптидной связи, а в других местах, так что обычно в одном эксперименте получают несколько серий пиков.

Два нанболес рельефных спектра обычно относятсн к заряженным фрагментам. полученным при разрыве псптидных связей, причем набор С-концевых фрагментов очень легко отличить от набора 1Ч-концевых фрагментов. Дело в том, что Камера МС-1 соударений МС-2 Детектор Иони<шция и Разде- О>рагмеп распыление ление тания я' о к' о н н ! ! н,н — с-с — н — с — с — и — с — с н н ! а н к' о л> н н ! ..о — с — с — н — с — с н ов< о у 200 400 500 800 1 000 е»е я' о я' о >! н н ! а як †с †с †н †с †с †н †с †с н н ! >! н к' о а к> н н ! ..о ° н — с — с — н — с — с н ! >! н он' о Рис.2.

Определение аминокислотной последовательности методом тандемной масс-спектрометрии. о) Раствор белка после протеолитического расщепления вводят в масс-спектрометр (МС-1). Пептиды сортируют, отбирая для дальнейшего анализа лишь один тип фрагментов. Зтот фрагмент далее подвергают фрагментации в камере, расположенной между двумя масс-спектрометрами. Во втором масс-спектрометре (МС-2) определяют значение >и/г для каждого фрагмента. Многие образовавшиеся при фрагментации ионы получаются в результате разрыва пептидных связей.

Характеристики

Тип файла
DJVU-файл
Размер
17,57 Mb
Тип материала
Предмет
Высшее учебное заведение

Список файлов книги

Свежие статьи
Популярно сейчас
А знаете ли Вы, что из года в год задания практически не меняются? Математика, преподаваемая в учебных заведениях, никак не менялась минимум 30 лет. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6418
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее