Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 46
Текст из файла (страница 46)
Тфрагположеп па С-конце, 0 поскольку не заканчивается на К(Лгд) или К (! уз). Б-1 ЕСААУНВГЕР1ВКРСЛЯМОЗ)перекрыиасгся сСТП!) и СТ4), О С) поэтому можно опрелел ить Б-2 ТКВСЧНЕВ их порядок. ОБ-3 АМКЬУ!АССРМ Ст.2) Ст.1! 04 Отз ЕСААЧНВРЕР!ВРНСАБМАЬ!КТЫАСПРМТКВСЧНБВ С-конец ОБ-з СБ-2) Рис. 3-27. Расщепление и секвеиирование пептидов и определение порядка расположения пептидных фрагментов. В первую очередь определяют аминокислотный состав и Н-концевую аминокислоту в исходном пептиде. Затем разрушают все имеющиеся в молекуле дисульфидные связи, мешающие секвенированию.
В данном полипептиде есть только два остатка цистеина (С) и, оютветственно, только одно возможное место локализации дисульфидной связи. В палипептидах с тремя и большим числом остатков цистеина расположение дисульфидных мостиков определяют так. как зто описано в тексте. Расшифровку однобуквенных и трехбуквенных обозначении аминокислот см. в табл. 3-1. Аминокислотную последовательность можно вывести на основании других данных Описанный выше метод не является единственным способомдляустановленияаминокислотнойпосле- довательности. Новые масс-спектрометрическне методы позволяют определять последовательности коротких пептидов (20-30 аминокнслотных остатков) всего за несколько минут (доп.
3-2). Кроме того, с развитием быстрых методов ссквенирования ДНК (!ш. 8), установлением 1143] Чапь 1. 3. Аминокислоты, пептиди и белки А 5 С 2 В 4 Е 2 Р 1 П 3 Полипептид состоит иэ 33 амипо- кислотных остатков. Существуют три участка распгспления трипсином: даа у остатка К (Ьуз) и один у К (Агд), т. е. при ращцеплепии будет получено четыре фрагмепть, Вромциан расщепляет последова- тельность у двух остатков М (Ме!) с образованием трех фрагмептон.
3.4 Структура белка: первичная структура [149! Масс-гпекгрометр является одшв< из важнейших приваров дтя химических исследований. Лпализируемыс молекулы (аналнты) сначала ионизируют в вакууме. Затем вновь образовавшиеся заряжеииыс частицы вводят в электрическое и(или) л<агпитнос поле, причел< их движение в поле зависит от отношения их массы к заряду (т/г).
Эта измеряемая величина может Г>ыть исполь:юваиа лля определения молекулярной массы (М) авзлита г высокой точностью. Масс-спектромстрия используется в качестве метода ана>иза уже долгие п>ды, по до относительно недавнею времени ие было возможности использовать этот метод лля изучения макромолскул, таких как белки и иуклеиповые кислоты. Дело в том, что измеревис отношения и/г осуществляется в газовой фазе, а вагревание или другая процедура, необходимая для перевода вещества в >ж>ообразпос состояние, обычно елече> за собой еп> разрушение.
В 1988 г. были и редл- ожси два подхода, поз вол и в и ше решить эту проблему. Водном методе белок >юмсшают в светоиоглощаю>ную матрицу Под действием пульсирующего лазерно > о излученияя белки в матрице ионизируются и выхолят из матрицы в вакуумнук> кал<еру. Этот метод, известный как лазерная десорбционно-ионизационная массспектрометрия (МАЕ1)1), успешно используется для определения молекулярных лисс <иирокого круга макромолекул. Во втором успешно примсцякяцемся методе макромолекулы переходят в газовую фазу пряли> ит раствора. Раствор а налита пропускают через раси ылитсльиук> головку, находя>цуюся в силыюм электрическом и< де, в результате чего раствор превращается в мельчайшие заряженные капельки.
Растворитель мгновенно испаряется, а заряжепныс макромолекулы а неповрежденном ниде оказываются в газовой фазе. Данный метал носит название электроспрея (Е$1- масс-спектрометрии). Протоны, присоединявшиеся к чакромолскулал< в процессе п)к>хождения через рагвнлитсльнос устройство, сообщают им дополнительный зарял. Значение параметра т/г опрелеляют в вакуул<иой камере. Масс-спектрометрия позволяет получить Гюльшое количество информации, необходимой для исслсдоваяий в облаем< протсомики, энзимолоп<и и химии Г>елка в целом. Для проведения экспериментов требуются минимальные количества образцов: достаточное количество белка для анализа можно получить, например, методом двумерного ш>ектрофореза.
Точное опредс- Г Масс- спектрометр Стеклянный капилляр Раствор образца Г Высок<к напряжение Вакуум 47 342 Рис. 1. Метод злектроспрея для определения молекулярной массы белка. а) Раствор белка распыляют в виде сильнозаряженных мельчайших капеле>ь пропуская через распыляющую головну, помещенную в сильное электрическое поле.
Растворитель испаряется, а ионы аналита (в данном случае с присоединенными протонами) подаются в масс-спектрометр для определения отношения ш/г. б) Полученный спектр представляет собой набор пиков, каждый из которых отличается от предыдущего (справа налево) увеличением массы и заряда на одну единицу. На вставке показан результат компьютерной обработки данного спектра. ление молекулярной массы белка — это один из кпочевых моментов ири его идентификации. Если масса белка известна, то метод масс-сиектрометрии позволяет дсгсктировать все изменения, происходящие при связывании кофакторов, ионов металла, при ковалсцтных модификациях белка и т. д.
На рис. 1 приведен пример определения молекулярной массы белка с помо>пью мепща злектроспрея. 100 $75 Й 25 О 0 600 1 000 1 200 1 400 1 600 11501 Часть 1. 3. Аминокислоты, пептиды и белки ?1ри переходе в газовук> фазу белок приобретает какосто количество протонов (т. е. положительных зарядов) от молекул растворителя. В результате образуется спектр частиц с различным отношением массы к заряду Каждый регистрируемый пик соответствует отдельному типу частиц, отличающсл>уся от соссднсп> на единицу заряда н единицу массы (на 1 протон). Молекулярную массу белка можно рассчитать по любым двум соседним пикам. Для одного пика: Мэи>Х (ш/г)т = пг где М вЂ” молекулярная масса белка, и, — число зарядов, Х вЂ” молекулярная масса добавленной группы (в лаипом случае протона).
Аналогично, для соседнего пика: М+ (пг + 1)Х (ш/г)> = Теперь у нас есть два неизвестных (М и и,) и два уравненияия, так что можем их решить сначала относительно иэ а затем относительно М; (и/а)з — Х и> = (ш/з» - ( ' ) М = и>1(~/з), — Х) Такой способ вычислений па основании значений и/а для любых двух пиков пз спектра (рис. 1, б) обычно позволяет найти массу белка с ошибкой, не прсвыша>ошей 0,01Ж (в данном случае анализировали белок аэролизин )г с М = 47 342).
Использование нескольких серий пиков, повторные вычисления и усреднение результатов могут еще более повысить точность определения молекулярной массы М. Компьютсрныс программы позволяя>т получить точный результат по значению и/з для одного пика (рис. 1, б, встанка). Масс-спектрометрия является бесценным инструментом, с помощью которого ьюжпо быстро определить короткук> аминокислотнук> последовательность неизвестного осака. Данный метод называется тандемной масс-спектрометрией.
Сначала раствор исследуемого белка обрабатывают протсазой или хиь>ичсскил> реагентом, чтобы получить смесь более коротких пептидов. Затем эту смесь подают в устройство, представляю>дсе собой два последовательно расположенных масс-спектрометра (рис. 2, и, веерху). В первом масс-спектромстре сл>есь ионизованпых пептидов сортирустся таким образом, ч'тобы только один тип фрагментов, полученных прп расщеплении, мог достичь слслух>шеи> отсека.
Этот образец, каждая молекула которого имеет определенный заряд, проходит через вакуумнук> камеру между двумя масс-снсктрометрами. В этой так называемой «камере соударений» псптил разрушается на еще более мелкие части под действием активных соударений с молекула>ш ипертноп> газа (аргона или гелия), подаваемоп> в камеру. Процесс проводится в таких условиях. чтобы кажлый отдельный псптидный фрагмент был разлелен в среднем не более чем на две части. Боль>пипство разрывов приходится на пептидные связи.
В данной реакции молекулы воды нс участвуют, так как все происхолит в вакуумной камере, поэтому среди продуктов реакции встречаются радикалы, например карбонильныс радикалы (рнс. 2, и). Заряд. находившийся на исходном фрагменте, теперь сосрслоточен на одной из его частей. Во втором л>асс-спектрометре происходит измерение отношений и/а всех заряженных фрагментов (пеааряжснные частицы нс регистрируются). В результате получают одну или несколько серий пиков. Данная серия пиков (рис.
2, 6) отражает наличие всех заряженных фрагментов, которые образовались при разрыве одного и того же тина связи (по в разных частях полипсптидной молекулы) с одной и той же стороны связи ()Ч или С). Соседние пики в одной серии различая>тся на одну аминокислоту. По разнице молекулярных масс соотвстствукнцих пиков можно определить, какая именно аминокислота стоит следующей в полипсптидной цепи. Сложность возникает только с идентификацией лсйцина и изолейцина, поскольку они имеют одинаковыс молекулярные массы. При разрушении пептида заряд может сохраняться как на >Ч-к>и>цевом, >ак и на С-концевом фрагменте, кроме того, возможен распад молекулы не по псптидной связи, а в других местах, так что обычно в одном эксперименте получают несколько серий пиков.
Два нанболес рельефных спектра обычно относятсн к заряженным фрагментам. полученным при разрыве псптидных связей, причем набор С-концевых фрагментов очень легко отличить от набора 1Ч-концевых фрагментов. Дело в том, что Камера МС-1 соударений МС-2 Детектор Иони<шция и Разде- О>рагмеп распыление ление тания я' о к' о н н ! ! н,н — с-с — н — с — с — и — с — с н н ! а н к' о л> н н ! ..о — с — с — н — с — с н ов< о у 200 400 500 800 1 000 е»е я' о я' о >! н н ! а як †с †с †н †с †с †н †с †с н н ! >! н к' о а к> н н ! ..о ° н — с — с — н — с — с н ! >! н он' о Рис.2.
Определение аминокислотной последовательности методом тандемной масс-спектрометрии. о) Раствор белка после протеолитического расщепления вводят в масс-спектрометр (МС-1). Пептиды сортируют, отбирая для дальнейшего анализа лишь один тип фрагментов. Зтот фрагмент далее подвергают фрагментации в камере, расположенной между двумя масс-спектрометрами. Во втором масс-спектрометре (МС-2) определяют значение >и/г для каждого фрагмента. Многие образовавшиеся при фрагментации ионы получаются в результате разрыва пептидных связей.