Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 42
Текст из файла (страница 42)
Снижение времени прохождения белка через колонку позволяет ограничить диффузию и тем самым значительно улучшить разрешение. Метод очистки нового белка каждый раз подбирают, исходя из опыта и здравого смысла. В большинстве случаев для очистки белка прихолится последовательно применять несколько различных методов, основанных на разделении белков всоответствии с различными параметрами и свойствами. Например, если определенная стадия очистки позволяет отлслить АТР-связывающие белки от белков, которые с АТР не связыватотся, то на следующей стадии очистки пеобхолимо отпел ить искомый белок от остальных АТР-связывающих белков на основании различия размеров или зарядов.
Выбор часто осуществляется эмпирически; иногда в поисках наиболее эффективного способа приходится опробовать множество разных подходов. Этот поиск иногда удается несколько сократить, если использовать методы очистки, применявшиеся ранее лля аналогичных белков. На сегодняшний день опубликованы протоколы выделения тысяч самых разных белков. Здравый смысл подсказывает, что такие недорогие методы, как осаждецие солями, следует использовать на начальных этапах очистки, когда общий объем смеси и количество примесей максимальны.
Применение хроматографических методов на первых этапах непрактично, поскольку для разделения большого объема образца требуется большое количество дорогостоящих хроматографических сред. Ио мере очистки препарата сто объем обычно сокращается (табл. 3-5), что делает возможнылт применение более сложных (п дорогих) хроматографических методов. Иййй Обыск фракция Обкаса кала >ос>аа Ь(юаа ачас>ки (ма) белка (ыг) 1: 1рсоки> экст!рак> 1 400 >0000 :>. Осз>яссс п>сс су. >ьфатоы амгаоиии ' 360 3 000 Х 11ои юбыскщ>я х)к>>я>>ограйяся... 90 "100 4 1еяи фядьсрмэш 60 " 100 3. Лффшиюя к!к>иа>сяраф>ш 6 Я Замечание: числеяиыс данные отражают состояние образца после проведенной яро>ссдуры очистки.
Определение активности я удельной активности приводится ниже (с. 140). Удс*.ак>>ая а>окаяас а (1„1кююкп>а > 10 Лксааааата (с, ааасяы) 100 000 33 300 600 16 000 06 000 60 (ЮО 60 000 43 000 1' 7 >о=Е= с 1136! Часть 1. 3. Аминокислоты, пепгиды и белки Белки можно разделить и охарактеризовать методом злектрофореза Еще один важный метод разделения белков основан на способности заряженных белков двигаться в электрическом поле — этот процесс называют злектрофорезом.
Электрофорсз редко используют для очистки больших количеств белков, поскольку оГ>ычно суп(сствуют другие, более простые методы, кроме того, этот процесс часто нарушает структуру и биологическую активность белка. Од>сако электрофорсз чрезвычайно широко >юпользустся как аналитический метод. Досп>ипство метода состоит в том, что белки можно не только разделить, но и визуализировать, что позволяет быстро оцепить количество белков в смеси или степень чистоты данного белкового препарата. Методом элсктрофорсза можно также определить важнейшие характеристики белка, например изоэлектричсскую точку и молекулярную массу.
Элсктрофорсз белков обычно проволят в геле, образованном перекрестно-сшитым полимерным веществом полиакриламидом (рис. 3-18). Полиакриламидный гель действует в качестве молекулярного сита, в котором скорость движения белков пропорциональна соотношению их заряда и массы. На скорость движения, кроме того, может влиять форма белковой люлекуды. Силой, заставляющей двигаться молекулы в электричсском поле, является электрический потенциал (Е). Элсктрофоретичсская подвижнс>сть молекулы ()>) представляет собой отношение скорости движения частипы (к) к электрическому потенциалу.
Электрофоретическая подвижность, кроме того, равна отношению сулсксарного заряда молекулы (У) к коэффициенту торможения (Г), связанному с форлюй молекулы. Таким образом, подвижность белка в геле в процессе электрофорсза определяется его размером и формой. Электрофорсз, пспользуюп(ийся для оценки чистоты белка и еп> молекулярной массы, проводят в присутствии детергснта додецилсульфата натрия (англ.
лос(>ит с(ос(есу( зи()оге, эРэ). О 1! )Ча' Π— 6 — Π— ССН > СН; !! 2!1' 2 О додсцплсульфат натрия (Я)э) Додсцилсульфат натрия связывается с большинством белков в количестве, с>ропорционадьном молекулярной массе белка, приблизительно одна молекула 8РЯ па каждые два аминокислотных остатка. В результате молекула белка приобретает больп>ой отрицательный заряд, по сравнению с которым собственный заряд белка оказывается несущественным; кроме того, все белки в присутствии 8РЯ характеризуются одинаковым отношением заряла к массе. При связывании молекул ЯР5 белки частично разворачиваютсяя и приобретают приблизительно одну и ту жс форму.
Таким образом, разделенис белков методом элсктро4>проза в присутствии Я)5 происходит почти исключительно в соответспши с их молекулярными массами: чем меныпс белок, тем быстрее оп движется. После проведения элсктрофореза белки виэуализируют с помощью красителя Куксасси синего, который окрашивает белки, но не окрашивает сам гель (рис. 3-18, 6). З.З Как работать с белками [1371 , Обр" г Лупка ( ": Направление движения >ф: Рис. 3-18. Электрофорез.
а) В лунки в верхней части полиакриламидного геля вносят различные образцы белков. При подключении электрического тока белки начинают двигаться внутри геля. Гель минимизирует как конвекционные потоки, вызванные небольшими температурными перепадами, так и перемещение белка за исключением того, что связано с движением в электрическом поле. б) После проведения электрофореза белки можно визуализировать, обработав гель раствором красителя Кумасси синего, который связывается только с белками, но не с гелем. Каждая полоса на геле соответствует отдельному белку (или субьединице белка); более мелкие белки мигрируют в геле быстрее, чем более крупные, и поэтому находятся в нижней части геля.
Результаты очистки белка КесА из Езс)>епс)>1а сой (см. гл. 25). Ген белка КесА был клонирован (гл. 9), так что его экспрессию (синтез белка) можно контролировать. Первая дорожка представляет собой набор стандартных белков с известными значениями М„которые служат в качестве маркеров. На двух следующих дорожках представлен набор белков Е. сой до и после индукции синтеза КесА соответственно. На четвертой дорожке нанесены белки из грубого клеточного экстракта.
Далее на дорожках (слева направо) последовательно представлены образцы после каждой стадии очистки. Очищенный белок имеет единственную полипептидную цепь с М, ~ 38 000. С помощью этого метода удобно следить за ходом очистки белка по количеству белковых полос, остающихся на геле после проведения каждой следующей стадии очистки. Сравнивая расстояния, пройденные в геле исследуемым белком и белками с известной молекулярной массой, можно оценить молекулярную массу исследуемого белка (рис. 3-19).
Белки, состоящие из нескольких субъединиц, при проведении злсктрофорсза в присутствии ЯЭБ обычно разделяются на отдельные субъединицы, каждая из которых видна как отдельная полоса. в) 505 гельзлектрофорез. 4щ Аз с ь м,. Ф Ф >уФ ч >3' зз ~+ б стандарт:>Г 97 400 — -4м> 66200 ЦИКВ й'- 45000 >>К>в а>Р > .:, 8(еф вжщ вязе й>888, 31 000 м 21600 ~щдз > 14400 !Фр 4~> Для нахождения численного значения изоэлектрической точки белка (р1) пользук>тся методом иаоэлектрофокусирования (рис. 3-20). Градиент рН создастся с помощью смеси низкомолскулярных органических кислот и оснований (амфолитов, с.
123), которые распределяются в геле под действием электрического поля. Если нанести на гель смесь белков, то в электрическом поле каждый из них движется до тех пор, пока пе достигнет области рН, совпадающей с его значением р! (табл. 3-6). Таким образом, белки с разными значениями изоэлектрических точек локализуются в разных участках геля. 1 2 Мп<лзпп 200 000 Р-Гэтакгозпджы 116250 Глпкогспфосфорплазз Ь 97 400 Бычий сывороточвый зльбумпп 66 200 Овальблумпп 45 000 Кврбовпгплрвзв 31 000 Соевый ппгпбптор трппсппа Лп:юд им М Неизвестный стандарты белок б Отпосптсдьпая подвижность Рис. 3-19. Оценка молекулярной массы белка.
На основании подвижности белка в процессе 505-электрофореза можно определить его молекулярную массу. а) Для определения неизвестной молекулярной массы белна (нанесен на дорожку 2) используют набор маркерных белнов с известными моленулярными массами (дорожка 1). б) По графику зависимости относительной подвижности маркерных белков от логарифма их молекулярных масс можно найти значение молекулярной массы неизвестного белка, В гель включают рН 9 . ы раствор амфолитов. рНЗ :'. Рис.
3-20. Иэоэлектрофокусирование. Данный метод позволяет разделить белки с различающимися значениями изоэлектричесних точек. С помощью раствора подходящих амфолитов создают градиент рН в геле Затем в лунку на геле наносят смесь белков. При подключении электрического поля белки входят в гель и движутся до тех пор, пока не достигнут тех областей, значения рН ноторых равны значениям изоэлектрических точек белнов (поснольку при рН = рГсуммарный зарядбелка равен нулю). [138[ Часть 1. 3. Аминокислоты, пептиды и белки Прп наложении электрического поля в гслс создастся устойчивый градпспт рН. Па гель наносят смесь После проведения белков и включают разделения гель злскгрпчсский ток. окрвгдпвввп1белки распрслсляготся влоль грвдпсптв рН в соответствии со зпвчсппямп рб ' Уменьшение Нш'кпп Яз имй ьттьбуипп Слзхцхпвчшзй злыстипн 3 )каза < 1,0 ',6 4.9.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
