Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 66
Текст из файла (страница 66)
Ц Ц Ц астр Буфер Буфер аоо аоо Время, е ~2 яя 2НЗ 12-17 В сердце, действуя через мускариновые репепторы, ацетилхолин открывает К '-каналы и уменьшает тем самым частоту сердечных сокращений. Обработка клеток сердца коклюшным токсином блокирует эту физиологическую реакцию на ацетилхолнн, на основании чего можно предположить, что в сопряжении процессов активации рецепторов и открывания каналов участвует О-белок. Непосредственно действие ацетилхолина можно изучать на вывернутых мембранах с помогцью модифицированной техники локальной фиксации (пэтч-кламп). По этому методу микропипеткой вырывают фрагмент клеточной мембраны, так что наружной стороной он контактирует с раствором в пипетке, а цитоплазматической стороной- с омывающим раствором, который можно быстро менять (рис.
12-9). В таком фрагменте мембраны сохраняются рецепторы, К'-каналы и О-белки. Измеряя текущий через мембрану ток можно определить состояние К'-каналов. Схема типичного эксперимента такого рода изображена на рис. 12-9. Когда ацетилхолин добавлен (что обозначено знаком «+») в пипетку, прикрепленную к целой клетке, через мембрану течет ток, указывая на то, что К '-каналы открыты (рис. 12-9, А), При тех же условиях во фрагменте мембраны, погруженном в буферный солевой раствор, тока нет (рис. 12-9, Б).
Если, однако, в омывающий раствор добавить ОТР (рис. 12-9, В), ток появляется. Удаление ОТР приводит к исчезновению тока (рис. 12-9, Г). Результаты серии подобных экспериментов, в которых определяли действие разных комбинаций компонентов системы, суммированы в табл. 12-1. А. Как видно из табл. 12-1 (4-я строчка), добавление в омывающий раствор ОррХр (негидролизуемого аналога ОТР) вызывало открывание К'-каналов даже в отсутствие ацетилхолина. Однако ток нарастал в этом случае очень медленно и достигал максимальной величины лишь спустя одну минуту (сравните с мгновенным «включением» тока на рис. 12-9, А и 12-9, В). Каким образом, по вашему мнению, Орр)ь(р вызывал открывание каналов в отсутствие ацетилхолина? Б. Объясните, почему О-белок, состоящий из двух субъединиц (Ояу), активировал (открывал) канал, а целый (гетеротримерный) О-белок-нет? Является лн в этой системе активным тот же компонент С-белка, который активирует в других клетках аденилатциклазу? 226 Главе 12 Добевлеяве в буфер К "-каки очяаеяоых комоааатов О-белка Добавлевве в буфер няэкомодекуляряых еоедваеяяб Ааетол- холяя Закрыт Открыт Закрыт Открыт Закрыт » Открыт Закрыт Без добавок -»- Беэ добавок ОТР ОТР ОРРЫр Беэ добавок -»вЂ” †»вЂ” 1.
2. 3. 6. 8. — »вЂ” О-белок Оа Оуэ О-белок после кипячения В. Дают ли эти эксперименты основание считать, что К+-кав скорее всего открываются при участии внутриклеточв посредника? Г. Нарисуйте на основе этих данных схему активации К+-канах в клетках серпща в ответ на ацетнлхолин. В ливии клеток, полученной из нормальной ткани щитовццн железы крысы, при стимуляции а,-адренергических рецепте увеличиваются одновременно образование инознтолфосфп и высвобождение арахидоновой кислоты.
Инозитолфосфатп вышает внутриклеточную концентрацию Сап, что приво к выходу тироксина, а арахидоновая кислота служит исто ком простагландина Еп„стимулирующего синтез ДНК. Кп же образом освобождение арахидоновой кислоты связано с тивацией адренергических рецепторов? Арахидоновая киспе может появляться при расщеплении диацилглицероллия диацилглицерола, образующегося вместе с инозитолфосфат Другой возможный механизм освобождения арахидоновой лоты — это независимое влияние рецептора на фосфолипазу 1 которая может непосредственно высвобождать арахидоно кислоту из интактных фосфоглицеридов, Проанализируйте дующие экспериментальные наблюдения. 1. Добавление к культивируемым клеткам норадрен стимулирует образование как инозитолфосфата, тпп арахидоновой кислоты.
2. Если сделать адренергические рецепторы нечувствнт к норадреналину, обработав клетки форболовым зф (активируя протеинкиназу С, он, видимо, вызывает лнрование рецепторов и тем самым их инактивацию), добавка норадреналина уже не приводит к увеличению держания в клетках ни инозитолфосфата, ни арахцдоя кислоты. 3. Если сделать клетки проницаемымн для ОТР-Т-Б (не лизуемый аналог ОТР), то синтез инознтолфосфата н а доновой кислоты увеличивается.
4. В клетках, обработанных неомицином (который блок действие фосфолипазы С), последующее добавление ОТР.1 стимулирует выход арахидоновой кислоты, но не в увеличения количества инозитолфосфата. 5. В клетках, обработанных коклюшным токсином, после 12-1о Таблица 12-1. Реакции К~-канала яа различные экспериментальные воздейств (эадача 12-17) Межкяеточная сигнализация 727 щее добавление СгТР-у-8 стимулирует образование инозитолфосфата, но не арахидоновой кислоты.
В пользу какого из двух предполагаемых механизмов образования арахидоновой кислоты в данных клетках говорят эти наблюдения? Предложите молекулярный механизм, объясняющий стимуляцию образования арахидоновой кислоты и согласующийся с экспериментальными данными. А. Б. Механизмы дейстиии циклического АМР и КОНОВ калыйин (МБК 12.4) 12-19 А Заполните пропуски в следующих утверждениях. Действие сАМР в животных клетках основано на активации им фермента, называемого Внутриклеточный рецептор ионов Саз+, регулирующий боль- шинство Са'+-зависимых процессов, — зто К наиболее важным мишеням, регулируемым внутриклеточ- ными комплексами Саз' — кальмодулин, относится семейство ферментов, называемых , которые фосфорилируют белки по остаткам серина и треонина.
Фермент катализирует образование сСгМР из СгТР. Г 12-20 В. Г. — Д Действует ли сАМР исключительно через А-киназу или существуют сАМР-связывающие белки, выполняющие другие важные 12-21 Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а ка- кие-нет.
Если утверждение неверно, объясните почему. Повышенное содержание сАМР в мышечных клетках способст- вует синтезу гликогена и подавлению его распада. В некоторых клетках увеличение концентрации сАМР приводит к фосфорилированию ДНК-связываюшего белка и вследствие этого к активации определенных генов. Циклический АМР активирует сАМР-зависимую протеинкина- зу, связываясь с ее регуляторными субъединицами и высвобож- дая тем самым каталитические субъединипы в виде активного димера. Эффекты фосфорилирования ключевых ферментов А-киназой обращаются под действием фосфорилаз, которые отщепляют от белков присоединенные фосфатные группы. Кальмодулин является интегральной частью фермента киназы фосфорилазы. В сенсорных органах, таких, как глаз и нос, циклические нуклеотиды регулируют ионные каналы за счет прямого связы- вания, а не путем влияния на обратимое фосфорилирование белков-мишеней. В клетках имеются эффективные механизмы разрушения сАМР и изоляции (секвестрирования) ионов Саз', нужные не только для завершения реакции на эти эффекторы, но также и для того, чтобы их концентрация могла резко увеличиться в ответ на сигнал.
Кальмодулин-зависимая протеинкиназа в клетках мозга — это регулируемый ионами Саз+ переключатель, который может участвовать в формировании памяти: единичный всплеск кон- центрации Саз+ может привести к тому, что протеинкиназа перейдет в устойчиво активированное состояние, поскольку одна из фосфорилируемых ею мишеней — это она сама. 228 Глава 12 В отличие от миозина скелетных мышц миозин гладких и взаимодействует с актином лишь тогда, когда его легкая фосфорилнрована.
Фосфорилирование регулируется из пнями внутриклеточной концентрадии Са", эффект кото опосредуется кальмодулином. Вы выделили из гладкой мы киназу легких цепей миозина, но активность ее опиям в присутствии и в отсутствие Са". Ваш коллега предяя добавить ингибиторы протеаз, чтобы быть уверенным в ся ненни интактности киназы в процессе выделения.
При з условиях получения киназная активность в экстракте обвар вается только в присутствии Саз' и кальмодулина. Вы проводите частичную очистку киназы методами фильтрации и ионообменной хроматографии, а затем, п зуясь методом аффинной хроматокрафии, пропускаете пре через колонку с кальмодулином в присутствии Са". К в радости, вся киназная активность сорбируется на коя а затем количественно элюнруется с нее при промывке ря ром ЭГТА — агента, хелатнрующего Саз+. Как видно вз и 12-22 функции, например в качестве ДНК-связывающих белков, у бактерий? Вы работаете с линией клеток хомячка, на кото этот вопрос можно изучить с помощью генетического аная В результате хромосомных перестроек многие гены в кл этой линии содержатся в виде только одной функциональ копии, что сильно облекчает выделение рецесснвных мутаций сравнению с нх выделением из полностью диплоидной лв Кроме того, высокий внутриклеточный уровень сАМР пятствует росту этих клеток.
Активируя аденнлатциклазу с мощью холерного токсина и интнбируя фосфоднэстеразу сА теофиллином, можно искусственно поднять в клетках уро сАМР. В таких условиях будут расти лишь клетки, устой к действию сАМР. Таким способом вы выделили несколько устойчивых кя ний, растущих в этих селективных условиях, н проверили в активность А-киназы. Все они оказались дефектными по кн признаку. Примерно 1О'4 устойчивых линий были полисе лишены А-киназной активности, у остальных она обнаруя лась, но для ее активации требовалась очень высокая кока рация сАМР. Для дальнейшей характеристики устойчивых ний вы провели слияние их с родительскими клетками и и рили гибриды на устойчивость к обработке холерным та ном.
Гибриды между родительскими клетками и клетяя лишенными активности А-киназы, оказались чувствитель к холерному токсину, что говорит о рецессивносги их мутя Напротив, гибриды родительских клеток с теми мутаки у которых была изменена чувствительность А-киназ к сА оказались резистентными к холерному токсину — следовате нх мутации доминантны. А. Является ли А-киназа в этих клетках необходимым фермент Б. Фермент А-киназа-это тетрамер, состоящий из двух катаяя ческих субъеднниц (собственно протеинкиназы) и двух рей торных (сАМР-связывающих) субьединиц. Предложите об пение тото факта, что в одних сАМР-резистентных л клеток мутации оказались рецесснвными, а в прутик-лю нантными.
В. Подтверждают ли эти эксперименты мнение, что все эффя сАМР в клетках хомячка реализуются с участием А-кивай Меж«легочная сигнализация 229 Дебавкн к реакяиеяией среде Аитавяесгь, % Способ аыделеаия Без добавок Са" Кальмолулия Сах' + кальмолулин Без добавок Сах « Кальмалулии Са + «альмолулии 50 50 50 50 ! ! 100 Без иигибитороа Без иягибитороа Без иягибиторов Без ингибитороа С иигвбиторами С янгибитораыи С иягибитораыи С иигибиторами 12-2, очищенная кнназа ведет себя, как и ожидалось; ее активность полностью зависит от наличия Са" и кальмодулина. Воодушевленные таким успехом, вы пытаетесь «реанимировать» первоначально выделенный вами препарат фермента, пропуская его через колонку с кальмодулииом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
