Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 61
Текст из файла (страница 61)
Мутанты с парализованными жгутиками обычно лишены тех нли иных существенных компонентов аксонемы, таких как радиальные спицы, наружные динеиновые ручки, внутренние линеиновые ручки, одна илн обе центральные микротрубочки. В большинстве случаев потеря элементов структуры аксонемы вызвана мутацией, затрагивающей только один ген, но тем не менее при биохимическом анализе обнаруживается, что в дефектной аксонеме недостает многих белков. Рассмотрим, например, мутант рУ'14 (от рага1ухег) Яане!1а): электронные фотомикрографии показывают, что он полностью лишен радиальных спиц (рис. 11-16, А), а прн анализе белков жгутика с помощью двумерного электрофореза выявляется отсутствие 1? различных белков (рис. 11-16, Б). Исчезновение многих белков в результате дефекта в одном гене можно обьяснить двумя путями: 1) дефект присутствует в регуляторном гене, который контролирует синтез исчезнувших белков; 2) дефект содержится в гене, продукт которого в норме должен присутствовать в структуре до того, как в иее включатся другие белки, Для проверки этих возможностей было использовано два подхода.
лерглфериеееклд Дублет 11-15. Жгутик, изогнувшийся уеольпо (задача 11-18), ебражение «внутреннего» и «наего» периферических дубле, отегоящих друг от друга ня еи. Б. Изображение соседних его», отстоягпих друг от друга 30 ям, и соелиняющих их молеяеяеина. у С)г?атуг?отолал В ходе спаривания происходит слияние двужгутиковых гамет, и временно образуется популяция дикарионов, несущих четыре жгутика.
При спаривании гамет р)'14 с гаметами дикого типа парализованные жгутики после слияния начинают функционировать, что указывает на возможность восстановления дефектных структур н без нх полной перестройки. (В нормальных клетках есть запас компонентов, достаточный для построения нового целого жгутика даже в отсутствие синтеза белка.) Чтобы выяснить, какой из возможных дефектов жгутиков имеет место, исследователи пометили мутантные А. Первый подход основан на особенности цикла спаривания 206 Глава 11 МУТАНТ р114 ч 4. а! 40 $ Зо 8 зо ~ !о и.
вп 60 50 ъ 4О 8 зо я Я 20 ~ !о о Рвс. 1 бочек стени юнце И-23) диме! субъе Рве. 11-16. Сопоставление ло утн- ков из Сиамудамолаг дикого типа и иэ мутанта р714 (задвча 11-20). А, Электронные фотомикрографии поперечных и продольных срезов жгутиков. Обратите внимание на отсутствие радиальных спиц у мутанта ру)4.
Б. Анализ жгутиков с помощью двумерного электро- фореза. Первое направление (гори- зонтальное)- разделение по изо- электрической точке (иэоэлектри- ческое фокусирование), более кислые белки расположены справа; второе направление- разделение по мол. массе (электрофорез в поли- акриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия). Стрелки указывают положение белков, которые есть в жгутиках клеток дикого типа, но отсутствуют в жгу- тиках мутанта ?Я)4. Сильно экспо- ннрованные области соответствуют а- и ))-тубулинам, количество кото- рых в аксонеме несравнимо больше количества всех прочих белков.
(По О. Р!регпо, В. Ннапк, 4.. Кашап!я, апд О. 1.псх, 1. Се1! В!о!. 88: 73-79, 1981. Перепечатано с разрешения Косхе(е!1ег Пп1гегзну Ргем.) клетки изотопом эзБО4, добавив его в среду для роста, и эата индуцировалн слияние меченых гамет мутанта с немеченыъз гаметами дикого типа (в присутствии ингибиторов белковон синтеза). Жгутики после восстановления их функции выдел кк и радиоактивные белки проанализировали с помощью двум е!! ного злектрофореза с последующей радноавтографией. Предположите, какой должна была быть злектрофоретичн кая картина радиоактивных белков жгутика днкариона, егл поврежденный ген контролировал синтез исчезнувших белки Чем она должна была отличаться от картины злектрофорегв ческого распределения для случая, если продукт дефектноп гена участвует в сборке жгутиковых структур? Б.
Второй подход состоял в обработке мутанта р) 14 мутагенех и поиске ревертантов, у которых функция жгутика восстановъь на не из-за исправления исходного дефекта, а в результхн вторичного изменения в том же гене, компенсирующего пер ю начальное. (Для некоторых генов такие внутригенные репорта ты могут быть довольно обычным явлением.) Белки из несколь ких таких ревертантов проанализировали с помощью двум ев ного злектрофореза и сравнили с белками из клеток диков типа.
Каким образом этот подход позволяет выбрать одно из двр возможных объяснений дефекта жгутика у р?" 14? Микротрубочки цитоилазмы (МБК 11.4) 11-21 Заполни~с пропуски в следующих утверждениях. А. Алкалонд прочно связывается с тубулином, п)в пятствуя его полимеризации. Б. Минус-концы микротрубочек скрыты в , которн1 служит центром образования звезды. В. Микротрубочки в клетках обладают свойством оно выражается в том, что индивидуальные микротрубочкн га Цитосквпет 207 время то равномерно растут, то быстро деполимеризуются. В функции входят стабилизация микротрубочек для предотвращения их распада и обеспечение их взаимодействия с другими компонентами клетки. Крупный белковый комплекс, называемый , перемещает везикулы вдоль аксональных микротрубочек в одном направлении-из тела клетки к концу аксона.
Д 11-22 Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а ка- кие-нет. Если утверждение неверно, объясните почему. Микротрубочки ответственны за регуляцию полярности клетки, за форму клетки, за подвижность, и, кроме того, они опреде- ляют плоскость, в которой происходит деление клетки. Добавленный к растущим в культуре клеткам колхицин за несколько минут блокирует все их на стадии митоза. Таксол стабилизирует микротрубочки. Быстрорастущие концы микротрубочек всегда направлены от полюса веретена. Дця полимеризации тубулина требуется ОТР.
Все микротрубочки, в том числе в ресничках и жгутиках, обнаруживают динамическую нестабильность. Переход микротрубочек в более устойчивые формы, сохраняю- щие интактность даже после обработки клеток колхицином, происходит при отщеплении тирозина и/или ацетилировании. Тубулин подвергается посттрансляцнонным модификациям только в состоянии свободного димера (но не в составе полиме- ра). Чтобы обеспечить движение везикул и органелл по аксону нервной клетки в обе стороны, микротрубочки в аксоне также ориентированы в обоих направлениях. Очищенный кинезин перемещает везикулы по микротрубочкам только в одном направлении. В Г И 4, 8 ОТСУТСТВИЕ ЦЕНТРОСОМ 30 М П-23 В 1О 20 30 40 00 Тубулин, мкм В ПРИСУТСТВИИ ЦЕНТРОСОМ Ва 40 20 И В 20 30 40 00 Тубулин, мкМ ,!И7.
Образование микротрув отсутствие (А) и в присут- (Б) цеатросом как функция цецтрации тубулява (задача .3). Концентрация указана для ров тубулана, служащих пяаацами при сборке. Б. Принято считать, что функции мнкротрубочек зависят от специфической пространственной организации их внутри клетки. Как же создается это пространственное распределение и чем определяется образование или исчезновение индивидуальных микротрубочек? Для ответа на эти вопросы исследовали сборку тубулина в микротрубочки щ у!!То. При концентрациях тубулина ниже 15 мкМ образования микротрубочек не происходило, но при более высоких концентрациях они интенсивно формировались (рис. !1-17, А). Если к раствору тубулина добавляли центросомы, микротрубочки начинали образовываться при концентрации ниже 5 мкМ (рис.
11-!7, Б). (В этих двух экспериментах использовали различные методы измерения -по общему весу мнкротрубочек (рис. 11-17, А) и по числу микротрубочек на одну центросому (рис. 11-17, Б), но определяемое снижение критической концентрации сборки микротрубочек в присутствии центросом не зависело от метода измерения.) Как вы думаете, почему концентрация, при которой начинается образование мнкротрубочек (критическая концентрация) различна в этих двух экспериментах? Почему кривая на рис.
1! -17, А в области концентраций тубулина выше 15 мкМ имеет линейно растущий участок, а кривая на рнс. 11-17,Б в области концентраций около 25 мкМ достигает плато? 208 Глава 11 В. В обычной клетке концентрация тубулиновых димеров (имени они являются «элементарными сборочными субъединицаым) составляет 1 мг!мл, а молекулярная масса димера тубуж на — 110 кДа. Какова молярная концентрация тубулина в клеп21 Как она соотносится с критической концентрацией в дв)4 описанных экспериментах? Какое это имеет значение для в)в цесса сборки микротрубочек в клетке? Рве. ВР01 Крв Помимо центросом, центрами нуклеации для сборки микрощ' бочек могут служить аксонемы жгутиков и кинет охоры.
Каха концом (плюс- или минус-) возникающая микротрубочка свхв на с этими структурами в точке нуклеации? Что~бы определит» какой конец микротрубочек присоединен к центросомам и 2222 тохорам, был поставлен следующий эксперимент. В качесп1 контроля были взяты аксонемы жгутиков, потому что их плкя и минус-концы можно различить. Кинетохоры, центросо ьз и аксонемы инкубировали в течение короткого проме жуп2 времени с немеченым тубулином, чтобы вызвать нукл и рост микротрубочек.
Затем был добавлен в высокой кш центрации тубулии, помеченный биотином, и инкубация и (в должалась еше 10 мин. По прошествии этого времени прела (0 ты фиксировали и содержащие биотин сегменты выявя гв с помощью меченных флуоресцеином антител к биотину. Из ряли длину меченных биотином сегментов и строили граф вя распределения микротрубочек по длине (рис, 11-18). А. Какой конец вновь образованной микротрубочки прикреплял ся к плюс-концу аксонемы жгутика? Б, Какой конец образованной на аксонеме микротрубочки раста быстрее? В. Какой конец собранной микротрубочки присоединен к цеи т1я соме? К кинетохору? Объясните ваш ответ.
11-24 А. АКСОНЕМЫ 00 $40 Я ; 20 0 Е 10 10 Лии в,мкм В. центРОсомы 00 «2 00 и $40 3 20 Из-за сложной кинетики процесса сборки микротрубочек п)хэ,.' сказать поведение индивидуальных микротрубочек очень тру но. Некоторые микротрубочки в популяции могут удлиня тыл даже если большинство других укорачиваются и исчеза кх ' Одно из простых объяснений такого поведения заключаек1 .
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
