Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 64
Текст из файла (страница 64)
На каком участке калибровочной кривой точность определения наибольшая и почему? В. Если имеющиеся у вас антитела были выработаны против свиного инсулина Гс человеческим он сходен, но не идентичен ему), будут ли оии пригодны для измерения этим методом концентрации инсулина человека? 12-6 Оптимум чувствительности метода радиоиммуноанализа наблюдается при равенстве концентраций определяемого вещества и радиоактивного стандарта.
Таким образом, абсолютная чувствительность метода лнмнтируется удельной радиоактивностью меченого лиганда. Чем выше удельная радиоактивность лиганда, тем меньше его можно добавлять в каждую пробу и, следовательно, тем меньшее количество вещества в анализируемом образце можно определить. 218 Глава 12 Вы хотите измерить концентрацию инсулина (молекуляр масса 11 466) в образце, пользуясь инсулином, меченным радио тинным йодом (период полураспада 7 сут).
Предположим, мечение производится из расчета один атом радиоактивного йе на молекулу инсулина, что йод не влияет на связывание нису антителами, что эффективность счета (вероятность зарегистр вать каждый радиоактивный распад как «импульс») составлг 50;4, а минимальное общее количество радиоактивности (связ ная + свободная) для данного метода должно быть не менее ! импульсов в минуту (имп/мин). А. Исходя из этого рассчитайте, сколько радиоактивного инсулина пикограммах) потребуется для одного определения.
Б. Сколько пикограммов немеченого инсулина можно будет обш жить при оптимальной чувствительности? ф ф сн, н-с-ин ОООН Рис. 12-2. Структура тароксяиа (зааача 12-?). Сигнализация с участием внутриклеточных рецепторов: механизмы действия стероидных гормонов (МБК 12.2) 12-8 Заполните пропуски в следующих утверждениях. А. Небольшое число -все они синтезируются из хол 12-7 Тиреоидный гормон тироксин состоит из двух соединенных д с другом йодированных остатков тирозина (рис. 12-2). В шитов ной железе он накапливается в специальных структурах, назыв мых фолликулами, причем в виде составной части гораздо бо крупного белка тиреоглобулина. Фолликул представляет с внеклеточную полость (просвет фолликула), окруженную клет эпителия.
При действии на щитовидную железу тнреотропи гормона (ТТГ) тироксин отщепляется с помощью протеаз тиреоглобулина и высвобождается в кровоток. Проследить в деталях цепь событий, конечное звено котор И выброс тироксина в кровь, оказалось совсем непросто. Ка~ щитовидная железа стимулируется ТТГ, в цитоплазме фолл парных клеток появляются капли коллоида. Сходство веще этих капель с веществом в просвете фолликула породило сивные споры о том, что представляют собой зти капли: вещ поставляемое фолликулярной клеткой в просвет (для поповне запаса), или, наоборот, вещество из просвета фолликула, пег щенное клеткой (для образования тироксина)? Вопрос был ра шен с помощью серии экспериментальных наблюдений.
1. Если пометить коллоид в просвете фолликула радиоакт йодом, гм1, а затем стимулировать фолликулы посредстэ ТТГ в условиях, предотвращающих дальнейшее включе метки, радиоактивность появляется во внутриклеточных лях. 2. Эти капли образуются спустя примерно 4 мин после добавле ТТГ и появляются сначала в апикальных выростах кл граничащих с просветом фолликула, затем в апикальной ча клетки и наконец в ее базальной части. 3. Находящийся в полости фолликула тиреоглобулин несет ток маннозо-б-фосфата, которым обычно маркируются для их доставки в лизосомы, Какой механизм образования тироксина и его выбрось фолликулярных клеток можно предложить на основе наблюдений? йяяжклеточная сигнализация 210 пя кто за па оет н- 30 Б В Г (в 12ий А. )т д- еее >й о >т В.
Г. па у ва но, пя о- е- — Д. 12-10 м м ие и- пя к, из гх Клаюлнан линия 2 Клеюлнан линии 1 гивридняя дяк + 1 1 + Декениетааои Проматор 1 Уронена аколрнхнн сят 80 20 100 г слт е- Знханаер Рпт. 12-3. Результат траасфокции ирп различных конструкций ДНК !две разные клеточные линии (цдпча 12-!О). Знак (+) означает присутствие, а знак (-) †отсутств п>рмона (дексамотозона). числа ояцчвют уровень экспрессии про- П>пта гена САТ(цо отношению в пто зкоцрессаи восле траисфекция е енотом видел — без вирусного яшек!а). рола — регулирует процессы развития и физиологические реакции у широкого круга организмов — от грибов до человека.
При связывании стероидного гормона рецептор претерпевает кон- формационное изменение (процесс, называемый ), в результате чего увеличивается сродство рецептора к ДНК и он приобретает способность связываться в ядре со специфическими генами и регулировать их транскрипцию. Гормон линьки у Оговор)ттуа называется Синдром, при котором у млекопитающих с мужским генотипом вследствие дефекта рецепторов тестостерона развиваются женские вторичные половые признаки, носит название Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а какие— нет. Если утверждение неверно, объясните почему. Все известные к настоящему времени стероидные гормоны яв- ляются ДНК-связывающими белками.
Физиологическая реакция на стероидные гормоны обычно про- ходит в две стадии, из которых лишь первая (первичный ответ) вызывается непосредственно связыванием гормон-рецепторного комплекса с ДНК. За связывание лиганда и за узнавание ДНК и активацию гена у рецепторов стероидных гормонов ответственны разные до- мены.
Рецептор для эстрадиола, кортизола и прогестерона кодируется одним геном. Все клетки, чувствительные к определенному стероидному гормо- ну, содержат один и тот же рецептор, однако ответы этих клеток на гормон могут сильно различаться, потому что для включения тех или иных генов помимо активированного рецептора стероидов могут требоваться и другие белки. Вы изучаете экспрессию генов, соединенных с регулируемым глюкокортикоидами сегментом вируса саркомы мышей Молони. Вы создали набор молекул ДНК, содержащих вирусный сегмент в обеих ориентациях выше и ниже репортерного гена (хлорамфениколацетилтрансферазы, САТ). Затем вы провели трансфекцию этими ДНК двух клеточных линий, происходящих из разных тканей, и измерили активность САТ в присутствии и в отсутствие глюкокортикоида (дексаметазона).
Изменение ориентации и местоположения вирусного сегмента относительно слабо влияло на экспрессию репортерного гена- результат, который следует ожидать, если вирусный сегмент содержит энхансер транскрипции. Результаты трансфекпии одним лишь геном САТ и геном САТ, соединенным с вирусным сегментом в одной (фиксированной) ориентации, показаны на рис. 12-3. Вы озадачены результатами для клеточной линии 1: вирусный сегмент усиливает экспрессию САТ в 20 раз в отсутствие дексаметазона! 220 Глава 12 Рис ДН' рец! ( л 12-11 Глюкокортикоцды индуцируют транскрипцию генов вируо опухоли молочной железы мышей (ММТЧ-щонзе щащнти) 1нглог ч(гнз).
Используя гибридные молекулы ДНК, в которы длинные концевые повторы (1.ТК-!опя 1ецп)па! гереа10) вируо были соединены с легко тестируемым геном, вы показали, чн ).ТК содержат регуляторные элементы, реагирующие на глюка кортикоиды. Чтобы картировать эти чувствительные к глюко кортнкоидам элементы в составе 1.ТК, вы произвели серва делеций, в результате которых были удалены различные 01: длине фрагменты ЬТК (рис. 12-4), и затем определили связи: ванне полученных сегментов ДНК с глюкокортикоиднымн рь, цепторами. Для измфрения связывания вы разрезали каж дуя мутантную ДНК на фрагменты, провели очистку фрагмента!, содержащих последовательности 1.ТК, и пометили их копая радиоактивным фосфором "Р.
Затем вы проинкубиров хи смесь меченых фрагментов с очищенным глюкокортикоидньи рецептором. Инкубационную смесь вы пропустили через витра целлюлозный фильтр, на котором белок (а вместе с ни! и связанная ДНК) адсорбируется, а свободная ДНК вЂ” нет. Свз. завщиеся с рецептором фрагменты ДНК вы выявили с аь мощью электрофореза в агарозном геле. Электрофоретически картина исходной смеси сегментов и сегментов, связаннн! с рецептором, показана на рис. 12-4.
1О Двнныв апвктрофорвзв ГиБРидные дни Искоднвм Фрвгманты, фрвгмвнты адсораированныт на фияатрв Транскрипция о -фЮ -ЗОО -аОО -Юо тмвиит чаяияр ые ф Чаяния 340 «аияф ля иаир 302 ччиивИ ц .ы. -' кп -240 Рае. 12-4. Схема делеций а 1.ТК и данные электрофореза для смеси исходных фрагментов ДНК и смеси фрагментов, которые связались с фильтрами (задача !2-1!). Нукле- отиды пронумерованы относитель- но начальной точки транскрипции (+ 1); отрицательные номера рас- положены перед ней, положитель- ные — после. В качестве картины электрофореза представлен радио- автограф агарозного геля. Ри пу~ же Б. В.
та О Чяжвяр (::Л 50 А. Содержат ли клетки обеих линий рецепторы глюкокортнкои дов? Что можно об этом сказать? Б. Чем клеточная линия 1 отличается от клеточной линии 2 Предложите возможное объяснение этого различия. В. Предскажите, исходя из вашего объяснения, результат эксперь мента, в котором перед геном САТ помещаются разнообразии более короткие участки вирусного сегмента, а затем аналогвь ным образом в двух линиях клеток проверяется активносв САТ.
Мвжклвточнвя сигнализации 221 ?вс.12-5. Последовательности ДНК, которые связываются с ?!повтором глюкокортикоидов (избача 12-11). 1. 6. 7. 8. 9. 10. 11. ССАА66А6666АСА6Т66СТ66АСТААТА6 66АСТААТА6ААСАТТАТТСТССАААААСТ ТС6ТТТТАА6ААСй6ТТТ6ТААССАААААС А66АТ6Т6А6АСАА6Т66ТТТССТ6АСТТ6 А66ААААТА6ААСАСТСА6А6СТСй6АТСА СА6А6СТСА6АТСА6ААССТТТ6АТАССАА СйТ6АТТСА6САСААААА6А6С6Т6Т6ССА СТ6ТТйТТА66АСАТС6ТССТТТССА66АС ССТА6Т6ТА6АТСА6ТСА6АТСА6АТТААА 6АТСй6ТСА6АТСА6АТТАААА6СААААА6 ТТССАААТй6АТССТТТТТ6СТТТТААТСТ А, НОРМА В каком месте 1.ТК расположены чувствительные к глюкокортикоидам элементы? На рисунке 12-5 приведены одиннадцать последовательностей ММТу' (некоторые из них входят в состав ЬТК), связывающихся с рецептором глюкокортнкоидов.
Можете ли вы найти в них обобщенную последовательность (консенсус-последовательность), с которой связывается рецептор? 0 2 4 6 8 10 12 Оваеление ющюона 12-12 6, ЦИКЛОГЕКСИМИД 0 2 4 6 8 10 12 !а!имение акдиаона емклогекеимида О. ЭКДИЗОН 1лулаеовал обрабогка! 100 $ 00 0 2 4 О 8 1О 12 арами,н !а!гели «е нанеона А. Удаление акдиаоне Ен гвб 12.6. Динамика образования дг)ов в хромосомах слюнных Идее (звдвча 12-12). А.
В норме. 1. В присутствии пиклогексимидв. В Волге удалеиив экдизоив. Личинки дрозофил линяют в ответ на повышение концентрации стероидного гормона экдизона. Замечательной экспериментальной системой для изучения гормон-индуцируемой активности генов служат политенные хромосомы слюнных желез дрозофилы, потому что нх активные гены увеличиваются в размерах, образуя пуфы, которые видны в световой микроскоп, причем величина пуфа пропорциональна скорости его транскрипции.
Некоторые пуфы, называемые межлинечными, активны и без добавки экдизона. Если же к выделеннь!м слюнным железам добавить экдизон, то эти межлинечные пуфы исчезают, зато возникают две группы новых пуфов. Первая группа (ранние пуфы) появляется уже спустя несколько минут после добавления экдизона, тогда как вторая (поздние пуфы) — лишь по прошествии 4 — 1О ч. Следует отметить, что концентрация экдизона на протяжении всего этого периода времени остается неизменной. Динамика появления и исчезновения пуфов после добавки экдизона схематично изображена на рис. 12-6, А. Два решающих эксперимента помогают прояснить взаимоотношения между пуфами различных классов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
