Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 68
Текст из файла (страница 68)
Продолжительная инкубация фибробластов с простагландинов Е, (РОЕ, ) вызывает у них десенситизацию и к другим агентац действующим через О;белок. Это явление называется гомолв гичной десенситизацией, поскольку оно имеет отношение к об щему белку (сг,); Наркоманам для обезболивания требуются более высокие доза морфина, чем обычным людям, потому что у них утрачеяк функциональные 6гбелки, а не в результате регуляции путев уменьшения количества рецепторов. Устройство жгутиков у Е. сой н 5. ~урЫтипит таково, чтч клетки двигаются по прямой, когда их жгутики врашаютсю против часовой стрелки, и начинают беспорядочно кувыркатьи при вращении жгутиков по часовой стрелке.
Если концентрация аттрактанта остается постоянной, бактерии продолжают двигаться по прямой. Хемотаксические рецепторы, активированные связанными ля. гандами, могут метилироваться, следствием чего будут вг инактивация и увеличение частоты кувырканий клеток, 12-27 Г. Ж. 12-28 После продолжительной инкубации с гормонами, которые свх. зываются с ))-адренергическими рецепторами, клетки становят. ся рефрактерными и перестают реагировать на сигнал. Дл изучения этого явления десенситизации вы используете иовоч вещество †С-12177, представляющее собой гидрофильную молекулу, специфически связываюшуюся с )э-адренорецептора. зиготные делеции этого гена приводят к уменьшению актиь ности фермента наполовину по сравнению с нормой? В.
Предскажите действие кофеина, ингибитора фосфодиэстеразх на способность к обучению у нормальных мух. Г. Доказывают ли эти эксперименты, что ген липее являега структурным геном фосфодиэстеразы сАМР? Если нет, то хя еще можно их истолковать? аяежклеточная сигнализация 233 ми. В отличие от связывания гидрофобного соединения дигидроальпренолола динамика связывания СОР-12177 в точности соответствуе~ уменьшению гормон-зависимой активности аденилатциклазы, наблюдаемому при возрастании времени воздействия изопротеренола на клетки (рис. 12-12).
Чтобы понять различие в связывании рецепторов с молекулами этих двух соединений, вы лизируете необработанные и обработанные изопротеренолом клетки, фракционируете их, центрифугируя в градиенте плотности сахарозы, и измеряете связывание дигидроальпренолола и СОР-12177 (рис. 12-13). Кроме связывания лигандов вы измеряете также активность маркера плазматических мембран-5'-нуклеотндазы. 8 100 е 50 о 5 0 А. Объясните различия в связывании дигидроальпренолола и 10 го Зо Время, мии СОР-12177. Б. Как вы думаете, что может лежать в основе десеиситизации, вызываемой в этих клетках изопротереиолом? .12-12. Активность адеиилатезы, сеязывавие Н-СОР-12177 Вызывание 'Н-дигилроальпреоле в разные моменты времеви е дсбавлеияя к клеткам изогерепола (задаче !2-28). Все еечины выражены в процентах от ечеяяя в нулевой момент еяя.
12-29 Десенситизация-это весьма общее явление, которое выражается в снижении чувствительности клеток к гормону (или к другому агенту) после длительного контакта с ним. Когда ослабляется реакция ~олько на десенситизирующий гормон (или на агент, действующий через тот же рецептор), десенситизация называется гомологичной. Если же падает чувствительность не только к десенситизирующему гормону, но и к веществам, действующим через другие рецепторы, эффект называют гетерологичной десенситизацией.
б-Адренергические рецепторы подвергаются и гомологичной, и гетерологнчной десенситизации, причем в обоих случаях происходит фосфорилирование рецептора. Вы выделили две различные протеинкиназы, предположительно участвующие в процессе десенсигизации ))-адренорецептора. Каждая из этих киназ в подходящих условиях фосфорилирует очищенные ))- адренорецепторы, встроенные в фосфолипидные везикулы. Один из ферментов, судя по всему, является А-киназой, поскольку для его активации необходим сАМР, активность же другого (который вы обозначили как неизвестный Х-киназой) нечувствительна ни к сАМР, ни к сОМР, ни к системам Са" — кальмодулин или Саз+ — диацилглицерол.
Вы измеряете способность каждой из этих киназ фосфорилировать ))-адренорецептор в присутствии и в отсутствие изопротеренола (активатора рецептора). Ваши результаты показаны на рис. 12-! 4. о,э 1000 $ и о е 500 $ 8 й 8*„ и а е е е о 80 01 < 12-13. Связывание лигаилов жетрекеах обреботапяых я вебегаявых изопротереиолом е по лаипым Левтрифугвроеае гржеиевте плотности сахаея (задача 12-28). В,ОО 0 15 5 10 Номер фракции 234 Глава 12 и. А-КИНАЗА 1 йй бо йи ио яр бо ~й ео 12-3О вя И яо ея яо ео врем»,мин б, х.кинязя еоо 1 бо р и а яо и о яо ео бремя, Рве. 12-14.
Киветиха фосфорилврованвя (1-алреиергичоского рецептора А-хииазой (А) в Х-книозой (Б) в присутствии и в отсутствие изодрогереаола (задача 12-29). 12-31 |оо : *1в о о о г о б Время иреямниубении, с 12-32 Рве. 12-15. Скорость дссенситвзацви необработанного ацетвлхолннового рецептора н двух препаратов фосфорвлировонного рецептора (задача 12-30). Стрелками показаны фракции фосфорилированных препаратов, сходные ао свойствам с необработанным рецептором. А.
Какая из двух киназ ответственна за гомологичную десен зацию В-адренергических рецепторов, а какая за гетерологи ную? Обоснуйте ваш ответ. Б. Предложите три механизма десенситизацни за счет фосфор рования ()-адренорецептора. Никотнновый ацетнлхолиновый рецептор (нАХР) представля собой регулируемый нейромедиатором ионный канал, иод роенный из субъединиц четырех типов. Рецептор фосфорв руется А-киназой, при этом один фосфат присоединяется у-субъединице и один к б-субъединнце.
Полностью фосфорв. рованные рецепторы десенситизируются гораздо быстрее, нефосфорилированные. Чтобы детально изучить процесс и сенситизацни, вы проводите фосфорилированне двух прела тов рецептора в условиях различного насыщения фосфато (О,о моль фосфата на 1 моль рецептора и 1,2 моль фосфата 1 моль рецептора) и измеряете развитие десенснтизации в тех ние нескольких секунд (рис. 12-15).
Оба препарата ведут себя х смесь разных форм рецептора: одна форма десенситизиру быстро (начальные крутые участки кривых), а другая с той скоростью, что и нефосфорилированный рецептор. А. Считая, что реакции фосфорилировання у- и б- субъедвв протекают независимо и с равными скоростями, рассчнта долю рецепторов, несущих О, 1 и 2 остатка фосфата на моле ., в двух препаратах с разной степенью фосфорилированноста Б. Можно ли на основании этих данных решить, сколько фосфя ных групп должно приходиться на рецептор, чтобы произо ла десенснтнзация, †од или две? Если вы установили, достаточно одной фосфатной группы, укажите, должна ли о быть присоединена к какой-то определенной субъединице к любой из двух? У Е. сод идентифицировано четыре типа хемотакснческнх цепторов.
Ими опосредуются хемотаксические реакции на различные аминокислоты, на сахара и на дипептиды. В качос практической задачи по бактериальному хемотаксису прево ватель дал вам штамм бактерий дикого типа, у котор имеются рецепторы всех четырех типов, и четыре мутан штамма, у каждого из которых недостает одного или бо рецепторов. Вам нужно выяснить, на какой аттрактант руст каждый рецептор. Схема эксперимента очень проста; наполняете капиллярную пипетку раствором аттрактанта, гружаете ее в буфер, где находятся бактерии, через 5 вынимаете н подсчитываете бактерии в капилляре. Ваши зультаты приведены в табл. 12-4. Определите, какому атту танту соответствует каждый из рецепторов.
Для выяснения взаимосвязи между структурой хемотакснч го рецептора и такими его функциями, как узнавание стяну передача сигнала и адаптация, вы клоннровали ген рецепт аспартата из ба!толейа гурЫтиг(ат. Помимо нормального вы клонировалн еще и мутантный ген, в котором недостает аминокислот на С-конце. Вводя клонированные вами гож нормальный (дикого типа) и укороченный — в мутантный Еа?толе??а, лишенный нормального гена для рецептора асда та, вы можете изучать различия между двумя клониров генами.
К вашему удивлению, укороченный рецептор в кле Межклеточнал сигнализация 236 Число клеток (тые.) а капилляре Серая Аецартат Рябова Поли ла- Без добацан аок Штамм Иатактаые рецепторы 105 95 84 77 0,7 59 06 65 59 85 6,6 !3 0,6 4,1 0,9 Гар, Тат, Тгб, Твг Тар, Тат, Тгб Тгб, Твг Тар, Тгб, Твг Тат, Тгб, Твг 59 0,7 34 55 70 0,5 0.8 0,6 0,5 0,8 не метилируется, хотя аминокислотные последовательности, по которым происходит метилирование у нормального рецептора, в нем сохранены. Оба клонированных рецептора связывают аспартат точно так же, как нормальный клеточный рецептор, лишь количество клонированных рецепторов на клетку в 15 раз болыпе, чем количество рецепторов в норме.
Чтобы понять, как клонированные рецепторы передают сигнал и каковы их адаптивные свойства, вы быстро меняете концентрацию аспартата в среде, где находятся бактерии. Бактерии дикого типа в отсутствие аттрактанта изменяют направление вращения (кувыркаются) каждые несколько секунд. При появлении же аттрактанта изменения в направлении вращения подавляются и бактерии какое-то время движутск по прямой, не кувыркаясь.
Если концентрация аттрактанта остается неизменной (пусть даже высокой), бактерии дикого типа быстро адаптируются к ней и снова начинают кувыркаться через каждые несколько секунд. Чтобы можно было наблюдать эти изменения в поведении в условиях эксперимента, вы прикрепляете бактерии жгутиками к покровному стеклу и теперь можете сколько угодно наблюдать за тем, в каком направлении они врашаются. Затем вы добавляете в среду аспартат и подсчитываете (с минутными интервалами) число бактерий, которые ни разу не изменили направление вращения после добавки аттрактанта.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
