Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 71
Текст из файла (страница 71)
Сыворотка может быть заменена тремя факторами роста: РФТ, ФРЭ и соматомедином С. Если три этих фактора вместе с соответствующими питательными веществами добавить к покоящимся клеткам, то через 12 ч они вступают в фазу Б. Если хотя бы один из этих факторов отсутствует, клетки в фазу 5 не вступают. Должны ли все эти три фактора роста присутствовать одновременно? Являются ли их эффекты независимыми, или же они стимулируют клетки, действуя поочередно в определенной последовательности? Чтобы ответить на эти вопросы, вы предварительно обрабатываете клетки факторами роста в определенной последовательности, а затем добавляете полноценную среду (содержащую сыворотку и питательные вещества) с 'Н-тимидином.
Через определенные промежутки времени после этого вы Таблица 13-2. Включение зН-тимилина клетками, растущими в обычных чашках и в чашках, обработанных ро!у(НЕМА) (задача 13-14) 246 Глава 13 фиксируете клетки и проводите их радиоавтографию. Врсгн появления первых меченых ядер вы отмечаете как время вхожве ния в фазу 3. Результаты этого опыта представлены в табл.
13-! Необходимы ли эти факторы роста клеткам одновремеюц независимо друг от друга или в определенной последоватеп ности? Поясните ваш ответ. Время до настуилеаи фазы 3 Порндок добавления Опьп 3 4 1 2 !2ч 12 ч 1ч бч 12 ч бч ФРЭ РФТ СомС Среда ФРЭ СомС РФТ вЂ” »в РФТ ФРЭ СомС вЂ” э— РФТ СомС ФРЭ вЂ” э— СомС ФРЭ РФТ вЂ” »- СомС РФТ ФРЭ вЂ” »в Клетки обрабатывали в течение 6 ч факторами роста, которые добавляли в укэзаээв порядке.
Перед добавлением следующего фактора роста юютки тщательно отмыээлх г предыдущего. После обработки факторами роста добавляли полную среду с 'Н-тимилекн и определяли время появления метки в влегочных ядрах. Молекулярные механизмы действия белковых факторов росч пока неясны, однако отдельные этапы процесса подцаются эк си риментальному исследованию. Например, ФРЭ стимулиру пролиферацию эпителиальных клеток многих типов при перв связывании с рецепторами ФРЭ на их поверхности. Роль реп тора ФРЭ в распространении сигнала пролиферацни ген проясняется благодаря изучению самого рецептора.
При зю широко используют клеточную линию А-43! мышиных фиб бластов, содержа~цих необычайно большое число рецепто ФРЭ, что существенно облегчает их исследование. Рассмотр следующую серию экспериментов. 1. Препараты плазматических мембран из клеток А-431 сод жат много белков, как показывает их анализ в ДСН-г (рис. 13-5, А). Однако при добавлении к такому препарв '"1-ФРЭ в присутствии агента, сшивающего белки, мс включают только два белка (рис. 13-5, Б, первая дорожи При добавлении к среде инкубации избытка немеченого Ф метка в полосе 170 кДа исчезает (рис. 13-5, Б, вторая до рот ка).
2. Если препарат мембран инкубировать с у-ззР-АТР, то неко рые белки, в том числе и белок с мол. массой 170 фосфорилируются. Включение в состав инкубационной си ФРЭ приводит к существенному ускорению этой реакции. 3. Если осадить белок 170 кДа с помощью специфичных к пс антител и затем повторить ннкубацию осадка с 7-"Р-АТР, белок 170 кДа фосфорилируется в ходе ФРЭ-стимулируен реакции (рис. 13-5, В, дорожка 3 и 4).
4. Если осажденный антителом белок вначале разгоняют ДСН-геле, а затем ренатурируют в этом геле, то последую 13-16 Таблица 13-3. Влияние предварительной обработки ЗТЗ-клеток факторами р ощ на срок вхождения в фазу 3 (задача 13-15) Рост м деление клеток к47 Вас. 13-5. Анализ рецептора ФРЭ д. 0КРАШЕННЫй ГЕЛЬ (идача 13-16). А. ДСН-гель прела)ага мембран из клеток А-431. Б. ДСН-гель препарата мембран аз ваток А-431, ипкубироаанных с и'1-ФРЭ а со сшивающим белки пеатом а присутствии в а отсутстгае избытка меченого ФРЭ.
170 В. ДСН-гель осажденного с иомошью антител рецептора ФРЭ, ваубвровааного с т-"Р-АТР в ЕН ирасугстааи я в отсутствие ФРЭ. Б. 1-ФРЭ и. 7 Р-АТР Неыечекый + Фйз Неыеченый ФРЭ кД кД 170 Куыасаи синий Рааиоаагограф Рааиааетоговй инкубация с 7-"Р-АТР в присутствии и в отсутствие ФРЭ приводит к такому же распределению, как приведенное на рис. 13-5, В.
А. Какой из опытов наиболее четко демонстрирует, что белок с мол. массой 170 кДа является рецептором ФРЭ? Б. Является ли рецептор ФРЭ субстратом для ФРЭ-стимулируемой протеннкиназы? Как это можно определить? В. Какие опыты показывают, что рецептор ФРЭ представляет собой протеинкиназу? Г. Можно ли сделать вывод, что рецептор ФРЭ служит субстратом для своей собственной протеинкиназной активности? 13-17 Было высказано предположение, что ограниченность числа делений нормальных клеток (до примерно 50 циклов) лимитирует максимальные размеры опухолей и тем самым обеспечивается некоторая защита от рака. Приняв, что 10' клеток имеют массу 1 г, рассчитайте массу опухоли, возникающей при 50 делениях одной раковой клетки.
Гены «социального контролю> клеточного деления (МБК 13.4) '13-18 Заполните пропуски в следующих утверждениях. А. Клетки злокачественных опухолей проникают в другие ткани тела, давая начало вторичным опухолям, называемым Б. Причиной возникновения опухолей некоторых типов служат , инфицирующие нормальные клетки. В. Клетки, не испытывающие социального контроля деления и вытесняющие благодаря более быстрому росту нормальные клетки, называют Г. Вирус саркомы Рауса относится к классу Д. Некоторые гены, называемые при попадании в нормальные клетки могут трансформировать их в раковые клетки.
Б. Трансформирующий ген вируса саркомы Рауса обозначается Ж. Гены нормальных клеток, гомологичные онкогенам, называют 248 Глава 13 13-19 Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а кь кие — нет. Если утверждение неверно, объясните почему. Для трансформированных клеток характерен целый ряд призна ков, которые можно разбить на трн группы: аномалии, связанны~ с плазматической мембраной, аномалии прикрепления н анома- лии роста и деления. Трансформация клетки может быть вызвана одним геном.
Температурочувствительные мутанты по гену ч-хгс из вирусэ саркомы Рауса были использованы для демонстрации того, что трансформирующий ген действует как переключатель в опреде. ленной ~очке клеточного цикла и в другое время не нужен длэ поддержания трансформированного состояния. При анализе трансформированных клеток на онкогены выяь ляются только доминантные онкогены. Рецессивные мутации генов социального контроля могут быль более распространенной причиной рака, чем доминантные му- тации.
В сущности все вирусные онкогены соответствуют либо естест- венным факторам роста, либо рецепторам естественных факто. ров роста. По-видимому, большую роль в трансформации клеток играет тирозинспецифическая протеинкиназная активность, которой обладает продукт гена к-кгс вируса саркомы Рауса. Продукт гена ч-хгс прикрепляется к плазматической мембран~ коротким отрезком из гидрофобных аминокислот на Х-коппс полипептндной цепи. Каким образом пролиферация клеток связана с их адгезией, неизвестно.
Нормальные клетки делятся только тогда, когда они плотно прикреплены к субстрату, а пролиферация трансформированных клеток существенно тормозится, если искусственно вызвать иг прикрепление к субстрату. Одинаковые размеры органов и тела у тритонов с разной плоидностью указывают на то, что необходимый для регуляции размеров тела контроль клеточно~о деления может зависеть от «измерения» длины, а не от простого «подсчета» числа клеток или циклов деления. Б.
В. Г. Е. И. Л. 13-20 Вирус саркомы Рауса (35Ч) содержит онкоген г-ягс, хоторый кодирует белок с мол. массой 60 кДа, известный как р60 '. Полагают, что этот белок вызывает трансформадию клеток, действуя в качестве тирозинспецифической протеинкиназы.
р60"' прикреплен к цнтоплазматической поверхности плазматической мембраны посредством связанной с его Х-концом миристиновой кислоты (жирная кислота С:14). Вы выделили мутант В37, у которого р60*" не связывается с миристиновой кислотой нз-за изменения на )ч-конце. Чтобы определить значение этого связывания для трансформации, вы инфицируете клетки мутантным вирусом и вирусом дикого типа н сравниваете свойства инфицн. рованных и неинфицированных клеток.
Как видно из данныг табл. 13-4, клетки, инфндированные мутантным вирусом, яе проявляют почти ни одного классического симптома трансформации. Анализ клеток, инфицированных мутантным вирусом, пока. зывает, что они содержат много белка р60*"„однако он находится в цитоплазме, а не связан с мембраной. Тем не менее в клетках, инфицированных мутантным вирусом, и в клетках, Рост и деление клеток 249 Признаки траясформацяи Неяифициро- Клетки, иафя- Клетки, ияфи- ванные клетки цяроваявые цироваияые КБУ дикого мутаятиым типа КБУ Рост ца мягком агарс Фиброцектиа Активатор плазмииогена Адгезиояные пластинки Повышение концентрации глюкозы Плотность насыщения, число клеток иа чашку + 2 10е +++ 1. 1О" 3 1Ое зараженных вирусом дикого типа, наблюдается одинаково высокая тирозинкиназная активность, превышающая активность в неинфнцированных клетках в 100 раз.
Вы удивлены и обескуражены таким результатом. Как может трансформация вызываться тирозинкиназной активностью, если она одинакова в случаях мутант'ного вируса и вируса дикого типа, а они при этом различаются по способности трансформировать клетки? Одно из объяснений может состоять в том, что ключевая мишень для фосфорилирования остается нефосфорнлированной в случае мутанта по рбО '. Исходя из этого, вы анализируете известные мишени фосфорилирования для рбО'м в инфицированных клетках.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
