Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 67
Текст из файла (страница 67)
К вашему удивлению, киназа проходит через колонку независимо от того, добавлен Са'+ или нет. А. Как вы объясните, почему первоначально выделенный фермент был активен независимо от присутствия Сах' н кальмодулнна и не задерживался на колонке с кальмодулином при аффинной хроматографии? Б. Опишите последовательность молекулярных событий, приводящих к сокращению гладких мышц.
Начните со входа Саз' в цитоплазму. В. Как вы считаете, можно лн использовать аффинную хроматографию на колонке с калъмодулином в качестве первой стадии очистки киназы легких цепей миозина? 12-23 Главная функция тромбоцитов-это регуляция свертывания крови. Когда тромбоцнты оказываются в контакте с состоящей из коллагеновых волокон базальной мембраной поврежденного кровеносного сосуда илн с образовавшимся сгустком фибрнна, онн изменяют свою форму — из округлых гладких становятся покрытыми «шипами» (отростками)-и прилипают к поврежденному участку. Тогда же они начинают секретнровать серо- тонин и АТР, стимулируюшие аналогичные изменения во вновь прибывающих тромбоцитах, что приводит к быстрому образованию тромба. Реакция тромбоцитов регулируется путем фосфорилирования белков. В связи с этим тромбоциты содержат в больших количествах две протеинкиназы — протеинкиназу С н киназу легких цепей миозина; первая инициирует выброс серотонина, вторая — изменение формы тромбоцита.
При активации тромбоцнтов тромбнном происходит фосфорилирование легких цепей миозина и нендентифнцнрованного белка с мол, массой 40 000 Да. Обработка тромбоцитов кальциевым ионофором приводит к фосфорнлированию только легких цепей миозина, обработка же днацилглицеролом- к фосфорилированию только белка с мол.массой 40 кДа. Эксперименты с использованием кальциевого ионофора и диацнлглицерола в различных сочетаниях показали, что степень фосфорилирования указанного белка 40 кДа зависит только от концентрации диацилглицерола (рис. 12-10, А), высвобождение же Таблица 12-2.
Активность хиназы легких цепей миозияа, выделенной а отсутствие и в присутствии ингибитороа протеаз (залача 12-22) 230 Главе 12 А Фоафорипироааниа А. лак на Фй Зй йЙ ик йй Фм яи в Б. цо рв Диацнлглицарол, мкг/мп Б. Вьняюо оарогонина -й а > и а оо кя во $Ь за Ф о м о цо го Диацнп л царап, мкг?мл 12-25 Рве. 12-10. Влияние обработки тромболвтов Сап'-вонофором в дввпвлглицеролом ив фосфорвлв- роввнве белка 40 кДа (А) я ва выброс серотоавнв (Е) (задача 12-23). Черные кружкв-в врвсут- ствив кальциевого яопофора, свет- лые — в его отсутствве, серотонина зависит как от диацилглицерола, так и от ионофо кальция (рис.
12-10, Б). Исходя из этих наблюдений опишите цель происходящих ~ норме молекулярных событий, ведущих к фосфорилировашв легких цепей миозина и белка с мол. массой 40 кДа. Объяснят( как влияет обработка диацилглицеролом и кальциевым иона фором на эти реакции. Почему для секреции серотонина необходимы одновременв и ионофор, и диацилглицерол? Удобным объектом для изучения компонентов, влияющих внутрнклеточный уровень Са", служат яйца морского В норме связывание со сперматозоидом вызывает увеличе внутриклеточной концентрации Са", которое, в свою очеред стимулирует экзоцнтоз тысяч маленьких везикул, содержавш строительный материал для образования фертнлизационне' мембраны. Поскольку эту мембрану можно легко увидав в световой микроскоп, ее формирование служит простым тк том на активацию яйца, дающим ответ типа «все или ничегш, Яйцо можно активировать н без сперматозоида, если прояне бировать его в среде с кальциевым ионофором, содержаш также и ионы Са '.
Узнав, что ннознтолфосфаты освобождают Саз' из внут(в клеточных запасов, вы тут же проверили их действие на аш морского ежа. Действительно, когда вы инъецировали в як 10 " моль (1,4,5)1пзР„образовалась фертнлизационная мвж брала. Однако активация зависела от наличия Сап' во вне ншб среде: добавление в среду ЭГТА-соединения, хелатнрующев Сапа †препятствова активации. Зависимость активации наружного кальция была для вас неожиданной, потому ч~ (1,4,5)1пзР, не открывае~ кальциевые каналы в плазматяв ской мембране. Другие ннозитолтрисфосфаты-(2,4,5)1пзРа ~ (1,3,4)1пзЄ— мобилизующие внутриклеточный Са" в др ути клетках, при инъекции в яйца морского ежа активацию в вызывали. Неэффективен оказался в этом отношения ~ (1,3,4,5)1пзР -инозитолтетракнсфосфат.
Однако при совместнв инъекции «неактивных» инозитолфосфатов — (2,4,5)1лвР, (1,3,4,5)1пзЄ— наблюдалась полная активация. Смесь (2,4,5)!пиР, с (1,3,4)1пзр, была неактивной, равно как и комбинация я (2,4,5)!пзР, со смесью изомеров 1пзРа случайного состава, я содержащей (1,3,4,5)1пвРо Эти результаты (табл. 12-3) поставили вас в тупик. й показываете нх некоторым своим коллегам и спрашиваете у вя совета. Один из них рассказывает вам, что слышал на семннзв о выделении ннознтолкиназы, специфично фосфорилирующ' инозитол и его производные по третьему положению. Эт обрывок информации все проясняет, теперь вы в состоянп сами разрешить вопросы, которые задавали коллегам.
Почему одновременное введение (2,4,5)1пзР, и (1,3,4,5)1пз?, активирует яйца, но по отдельности эти вещества неэффекпв ны? Почему (1,4,5)!пзР, способен «в одиночку» активировать я"яш Почему этого не может сделать смесь из (2,4,5)1пзР, ~ . (1,3,4) !парэ? Весьма наглядная иллюстрация одной хотя и второстепенае! . но все же важной функции сАМР на уровне организма был Межкпоточная снгналнзация 231 Таблица 12-3. Активация янц морского ежа (задача 12-24) Добавки к среде Активация янц Инъсццрованные ннознтнды Нет Да Нет Без добавок Саз+ Са" н ЭГТА Саг > 1.
(1,4,5)1озР 2. (1 4,5)1нзР, 3. (1,4,5)1нзР> 4. (2,4,5)1озРз 5. (1,3,4)1взРз б. (1,3,4,5)1озР4 7. (2,4,5)1нзР н (1,3,4,5)1нзР» 8. (2,4,Я1озР н (1,3,4)1шР> 9. (2,4,5)1озР, н (зг,х,у,н)1озР» — »вЂ” — »- †»- — »- — »вЂ” — »вЂ” — »вЂ” †»- †»- (Ых,у,з)!с»Р» — смесь нзомеров 1нзР» случайного состава. < нее» Рне. 12-11. Распределение актив- нсстн фосфоднзстеразы сАМР нрн зентрнфугнрованнн гомогенатов нз нормальных мух н нз >(ивсе-мутан- тсн н градиенте плотности саха- рсзы (задача 12-25). получена в исследованиях, проводившихся на плодовой мушке 1)гозорЫ1а п>е!аподазтег. В одной из лабораторий в поисках гена фосфодиэстеразы сАМР проводили измерения содержания этого фермента у мух с хромосомными дупликациями или делециями и обнаружили заметные отююнения в тех случаях, когда мутации затрагивали сегменты ЗРЗ и ЗР4 на Х-хромосоме.
Дупликации в этой области приводили к 1,5-кратному увеличению активности, делении — к уменьшению активности вдвое. При делециях наблюдалось частичная стерильность самок. В другой лаборатории того же института при изучении поведенческих мутантов дрозофилы обратили внимание на тот же участок Х-хромосомы. Исследователи разработали тест на обучение, в котором мухам предлагали две металлические сетки, одна из которых находилась под током. Если сетка под током была намазана пахучим веществом, нормальные мухи быстро обучались избегать ее и продолжали это делать, даже когда ток отключали. В отличие от них мутантные мухи не научились избегать пахнущей сетки; они были названы е(ипсе-мутантами.
Мутация е(ипсе (тупица) была генетически карти- рована и отнесена к сегментам ЗРЗ и ЗР4. У мух, отобранных по этому признаку, наблюдалась также частичная стерильность самок. Действительно ли этот дефект обучаемости — результат отсутствия фосфодиэстеразы сАМР или же просто соответствующие гены тесно связаны? Дальнейшие эксперименты показали, что у е(ипсе-мутантов уровень сАМР в 1,6 раза выше, чем у нормальных мух. Кроме того, при центрифугировании гомогенатов нормальных мух и ей>псе-мутантов в градиенте сахарозы оказалось, что фосфодиэстераза сАМР в норме дает два пика, один из которых отсутствует у е(ипсе-мутантов (рис. 12-11).
А. Почему у е(ипсе-мутантов уровень сАМР выше, чем у нормальных мух? Б. Объясните, почему гомозиготные (дефект в обеих хромосомах) дупликации немутировавшего гена е(ипсе вызывают увеличение содержания фосфодиэстеразы сАМР в 1,5 раза и почему гомо- 232 Глава 12 Адаптация клеток-мишеней (МБК 12.5) Заполните пропуски в следующих утверждениях. Клетки обратимо регулируют свою чувствительность к стимух) за счет процесса, называемого Опосредуемый рецепторами эндоцитоз лигандов часто сопря жен с уменьшением общего числа рецепторов клеточной яв верхности, что связано с их ускоренной деградацией; этж механизм известен как Когда рецепторы в присутствии лиганда интернализуются, н~ не разрушаются, клетки становятся менее чувствительиыа к добавленному лиганду; этот процесс называется У бактерий информация о присутствии во внешней среде ач трактантов и репеллентов передается через мембрану с ш мощью четырех типов.
12-26 А В Г Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а кв кие — нет. Если утверждение неверно, объясните почему. Большинство рецепторов, подвергшихся эндоцитозу, достав лают свои лиганды в лизосомы, где те подвергаются деграль ции, а сами вновь возвращаются в мембрану (рециклизуютсх). Продолжителъное действие на клетку какого-либо стимуп вызывает потерю чувствительности к данному стимулу.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
