Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 70
Текст из файла (страница 70)
А. Какой коэффициент разбавления вы получаете после 1О переносов по 50 нл в 1000 нл? Считаете ли вы, что биологическое действие соединения может не снижаться при таком падении концентрации? Б. Как может активность МРГ, обусловленная отсутствующим в незрелых ооцитах белком, появляться в активированных яйцах, если белковый синтез блокирован циклогексимидом? В. Предложите механизм, за счет которого активность МРГ мо~ла бы сохраняться при повторных серийных переносах.
Г. Какую роль должен играть пнклогексимид-чувствительный фактор, необходимый для появления активности МРГ в ооцитах, стимулированных прогестероном? га лгг гя ке т- ае зв зя за го м оет гт гс. аз и- к- а- гй Дрожжи как модельная система (МБК 13.2) В. Температурочувствительные мутанты не растут при температуре, но растут при температуре.
Г. Мутации у дрожжей вызывают блокирование либо нарушение той или иной части клеточного цикла. Д. В клеточном цикле дрожжей существует критическая точка, называемая , прохождение которой означает, что цикл клеточного деления будет обязательно завершен. ,м ок.
ле иэт зв 13-9 Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а какие— нет. Если утверждение неверно, объясните почему. Дрожжи важны для исследований клеточного цикла в первую очередь потому, что их можно выращивать в больших количест- вах, необходимых при биохимическом анализе. Наиболее существенные регуляторы клеточного цикла у дрож- жей-это тип питания н пол. У дрожжей ингибирование синтеза ДНК вызывает и прекращение цитокинеза; однако мутанты, не способные осуществлять цитоки- нез, могут многократно повторять цикл синтеза ДНК.
У клеток данного типа объем примерно пропорционален содержа- нию ДНК. 1 омологичные белки, кодируемые у 5. сегесбтгае геном С?УС28 и у 5. ронге геном С?ЭС2~, являются протеинкиназами. % гнц 13-8 Заполните пропуски в следующих утверждениях. А. Микроорганизм 5ассЛагогнусех сегеплае относится к Б. Микроорганизм 5с?г|хогасс?гаготусез ролйе относится к 242 Глава 13 Когда после голодания клетки дрожжей помещают в богат питательную среду, они быстро проходят точку старта и воз новляют клеточный цикл.
ж 1: !х !х 13-11 Вы выделили температурочувствнтельный мутантный почкуюшихся дрожжей. Он хорошо растет при 25'С, но при 31 все клетки образуют по крупной почке, а затем прекращают К моменту прекращения роста клетки приобретают характер морфологию (!апйпаг!с тогрЬо!оду). Синхронизировать рост клеток такого мутанта очень тру но вам хотелось бы как можно точнее установить, в какой то клеточного цикла температурочувствительный продукт гена х жен действовать, чтобы клетка завершила цикл. Критич точка, где действует данный продукт,— зто «точка удара» мутанта.
Один толковый приятель, у которого есть хоро микроскоп с нагревательным столиком и видеокамера для ц раферной съемки, предлагает вам заснять клетки в поле зре при повышении температуры и проследить таким способов поведением отдельных клеток при остановке их роста. Песке это неподвижный организм, то относительно легко наблюдав изменениями в индивидуальных клетках. Чтобы разобра 13-10 Мутации, блокирующие ту или иную фазу клеточного цих.
очень важны для выявления механизмов его регуляции и кон роля. У дрожжей выявлено болыпое количество таких мута Обычно для характеристик мутантов по клеточному циклу (с определяют сначала фазу, на которой блокирован цикл. Те ратурочувствительные спс-мутанты особенно ценны, потому они нормально растут при одной (пермиссивной) температуре, проявляют мутантный фенотип при более высокой (рестр ной) температуре. В одном из методов, применяемых для из ния температурочувствительных с«с-мутаций, используется г роксимочевина-токсичное соединение, блокирующее сшп ДНК за счет ингибирования рибонуклеотидредуктазы (пос ляющей предшественники дезоксирибонуклеотидов).
Блок синтеза ДНК гидроксимочевиной можно снять, просто заме среду инкубации. Рассмотрим опыты с гипотетическими спстантами 101 и !02. Вы инкубируете культуру мутанта сс(с!О! дрожжей при риктивной температуре (37'С) в течение 2 ч (приблизитель продолжительность клеточного цикла у дрожжей) с тем, что проявился мутантный фенотип. Затем вы переносите кл в среду, содержащую гидроксимочевину, и инкубируете их пермиссивной температуре (20'С). Клетки не делятся.
Изменив порядок обработки, вы инкубируете культуру танга с«с!01 при 20*С в течение 2 ч в среде, содержащей гид симочевину, а затем переносите клетки в среду без гидроксяя чевины и инкубируете при 37'С. Клетки проходят один деления. Вы повторяете эти два опыта с мутантом с»(с!02.
Клетки делятся ни в одном случае. А. В какой фазе клеточного цикла блокирован мутант спс10! рестриктивной температуре? Объясните результаты опыте» обратной сменой температуры. Б. В какой фазе клеточного цикла блокирован мутант сг(с!02 рестриктивной температуре? Объясните результаты опыте» обратной сменой температуры. Рост и деление клеток 243 Рве.13 4. Цейтраферная съемка веток температурочувствительмго мутанта дрожжей (задача В-!1). Клетки во внутреннем круге ~асположенъг в порядке изменения рззиеров их почек, т.е. по фазам клеточного цикла.
После инкубации крв 35 гС в течение 6 ч они преЧкшаются в клетки, расположенние ~о внешнему кругу. Дальнейшего роста и деления не пронколнг. в результатах наблюдений, вы располагаете фотографии клеток, относящиеся к началу опыта, по кругу в порядке увеличения размеров дочерних почек. Затем вы находите фотографии тех же клеток, сделанные через 6 ч, когда рост полностью прекратился. Результаты вашего опыта представлены на рис.
!3-4. А. Укажите на рис. 13-4, где находится тачка удара для мутанта. Б. Соответствует ли точка удара моменту остановки клеточного цикла у вашего мутанта? Что вы можете сказать по этому поводу? Регуляция клеточного деления у многоклеточных организмов (МБК 13.3) 13-12 Заполните пропуски в следующих утверждениях. А. В конце фазы О, цикла деления клеток выспюих эукариот есть момент, после которо~о возврат в состояние покоя невозможен; он называется В этой точке клеточного цикла возможна пауза, если условия среды препятствуют его продолжению. Б. Белки сыворотки крови, которые непосредственно и специфи- чески стимулируют деление клеток, называются В.
Основной фактор в составе сыворотки крови, который делает фибробласты в тканевой культуре способными делиться,-это Г. При культивировании нормальных клеток в суспензии, где они не прикреплены ни к какой твердой поверхности, деления почти никогда не происходит; это явление известно как Д. При неблагоприятных для деления условиях клетки не проходят точку рестрикции и задерживаются в Е. Фибробласты, взятые от нормального человеческого плода, совершают около 50 делений, затем прекращают делиться и погибают; это явление обусловлено 13-13 Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а ка- кие-нет.
Если утверждение неверно, объясните почему. 244 Глава 13 Время, необходимое клетке, чтобы пройти от начала фазы б завершения митоза,-это более или менее постоянный парамеп При дефиците основных питательных веществ клетки высшя эукариот останавливаются в фазе Й, клеточного цикла в точц соответствующей точке старта у дрожжей. Если бы клетки в ткани делились синхронно, то могла би нарушиться целостность ткани, поскольку во время каждог митоза все клетки «округляются» и теряют контакт друг с ду) гом. Сыворотка крови поддерживает рост фибробластов, а плат нет, поскольку в плазме содержатся факторы свертывания кроэ тормозящие рост клеток. Нетрансформированные клетки растут и делятся только в тои случае, если они полностью распластаны на поверхности за сче прикрепления к субстрату; трансформированные клетки спосо6 ны расти в суспензии, сохраняя округлую форму.
Регуляция клеточного деления, по-видимому, сопряжена с ор в низацией цитоскелета. Утрата контроля за ростом у раковых клеток почти всегя связана с существенным увеличением клеточной адгезивностя. В фазе О, клетки растут, а в фазе О, нет. В искусственной среде, содержащей специфические факто)я роста, клетки из зародыша мыши растут лучше, чем в сыворота крови; это свидетельствует о том, что сыворотка наряду а стимуляторами роста содержит также и ингибиторы роста. Люди с синдромом Вернера преждевременно старятся.
В Г Е .. 3. И К 13-14 Случайность помогла провести продуктивную серию экспер~ ментов. При пересадке линии культивируемых клеток вы потерь ли одну из своих контактных линз; несколько дней спустя ви обнаружили линзу на дне чашки Петри. Интересно, что клегп, прикрепленные к линзе, были редко разбросаны и имели окр)г лую форму, тогда как в других участках чашки они б цв распластаны и лежали почти плотно. «Ага!-подумали вы.— Нз верное, это наблюдение можно использовать для исследоваяи зависимости между формой клеток и регуляцией роста».
Кя говорится, случай благоприятствует подготовленному уму. Фирма-изготовитель любезно прислала вам образцы илзе тика ро!у(НЕМА), из которого были сделаны ваши магия контактные линзы. Если спиртовый раствор ро1у(НЕМА) хзя путь на пластиковую культуральную чашку, то после испаре хп спирта на пластиковой поверхности остается тонкая тверди стерильная пленка прозрачного полимера. Приготовив серийн ы' разведения спиртового раствора полимера и внеся их одинаковии по объему образцы в разные чашки, вы получили ряд подь мерных пленок с уменьшающейся толщиной.
Оказалось, что ча тоньше пленка, тем сильнее клетки прикрепляются к чапца Более того, с уменьшением толщины пленки происходит посте . пенное изменение формы клеток от округлой до плоской. Иа пользуя высоту клеток как показатель их формы (опускза технические подробности), вы установили, что имеется прями зависимость между формой клетки и ростовым потенциалок чем более клетки уплощены, тем лучше они включают зН-тими дин. Теперь главный вопрос: определяется ли зависимое от плот. ности торможение роста клеток изменениями формы клеток? Вя выращиваете различные по плотности (по степени конфлюевь ' Рост н деление клеток 245 ности клеток) культуры в обычных пластиковых чашках и измеряете высоту клеток и их способность включать Н-тимидин.
Как показано в табл. 13-2, чем более тесно лежат клетки, тем больше их высота и тем хуже они включают Н-тимидин. С чем связано ухудшение роста: с увеличением скученности клеток или с изменением их формы? Для ответа на этот вопрос вы распределяете клетки при низкой плотности в чашках с пленкой ро1у(НЕМА) так, чтобы высота клеток в каждой из разреженных культур соответствовала высоте клеток в соответствующей плотной культуре. Результаты ваших измерений по включению 'Н-тимидина в таких разреженных культурах приведены в табл. 13-2. Тии чашки Высота Включение зН- клеток, тимидина, мкм ими/мии на 1 чашку Число клеток иа чашку Плотность Расиоложения Необработанная Необработанная Необработанная Ро1у(НЕМА) Ро1у(НЕМА) Ро!у(НЕМА) 60 000 200 000 500000 30 000 30 000 30000 Почти плотно Плотно Плотно Редко Редко репко 6 15 22 6 15 22 15 200 11 000 3 500 7 500 ! 500 2!О Какой вывод могли бы вы сделать на основе результатов, представленных в табл.
13-2: коррелирует ли зависимое от плотности торможение роста клеток полностью, частично или не коррелирует вовсе с изменениями формы клеток? Обоснуйте ваше заключение. 13-15 Клетки позвоночных задерживаются в фазе О, клеточного цикла до тех пор, пока условия существования не станут благоприятными для вхождения в фазу $ с последующим делением клетки. Некоторые потребности в факторах роста для прохождения фибробластами фазы О, были определены с использованием 3Т3-клеток мыши, представляющих собой фибробластоподобную линию. В отсутствие сыворотки крови эти клетки не вступают в фазу Б, но если к культуре таких «остановленных» клеток добавить сыворотку, они проходят фазу О, и через 12 ч вступают в фазу Б.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
