С.Г. Инге-Вечтомов - Генетика с основами селекции (1117682), страница 51
Текст из файла (страница 51)
2. Электрофорез полученных меченых фрагментов в денатурирующем полиакриламидном геле с высокой разрешающей способностью, позволяющей разделять полинуклеотиды, отличающиеся на один нуклеотид. 3. Выявление положения меченых фрагментов с помощью радиоавтографии. Секвенирование олигонуклеотндов по методу Максама — Гилберта. В качестве примера определим первичную структуру однонитевого декануклеотида: 5'-САТСАТСАбб-3' Метить радиоактивным изотопом фосфора ~'Р удобнее с помощьк> фермента полинуклеогидкиназы фага Т4 и "Р у АТФ: декануклеотид-ЗОН Затем меченую ДНК делят на четыре порции и подвергают химическому гидролизу в таких условиях, чтобы в среднем на одну молекулу пришелся один разрыв в специфическом сайте.
В разработке таких специфических реакций большая заслуга принадлежит советскому ученому Е. Д. Свердлову. Эти реакции состоят из этапов модификации нуклеотидов и разрыва ДНК в месте модификации (рис. 11.14, А). В результате'этих реакций в пробах будут появляться наборы меченых олигонуклеотидов (рис. 11.14, Б). Продукты реакций подвергают электрофорезу в денатурнрующем полиакриламидном геле, и получают радиоавтограф геля на рентгеновской пленке. Прн этом следует помнить, что скорость миграции фрагментов обратно пропорциоанальна их длине. С учетом этого прямо с радиоавтографа считывают нуклеотидную последовательность (рис. 11.14Б, справа) .
На одном геле можно прочитать последовательность длиной в 200 — 300 п. н. При помощи метода Максама — Гилберта можно секвенировать как однонитевую, так и двунитевую ДНК, так как меченный с одного конца двунитевой фрагмент ДНК несет метку только с 5'-конца одной нити ДНК.
Стратегия секвенирования длинных () 1000 п.н.) фрагментов ДНК состоит в следующем: — Выделение препаративного количества ДНК исследуемого фрагмента. — Расщепление этого фрагмента на более мелкие с помощью эндонуклеаз рестрикации и мечение образовавшихся концов (с помощью полинуклеотидкиназы и '~РРАТФ или при застройке «липких» концов большим фрагментом ДНК-полимеразы 1, сохранившим полимеразную, но не экзонуклеазную активность — см. гл.
б— в присутствии нуклеозидтрифосфатов, один нз которых мечен «~Р в а-положенни). На этом этапе обычно получаются фрагменты, меченные с обоих концов, поэтому каждый меченый фрагмент выделяют из геля и либо подвергают электрофорезу для разделения цепей, либо гидралнзуют еще одной рестриктазой для получения субфрагментов, несущих "'Р только с одного конца. — Определение нуклеотидных последовательностей всех меченных с одного конца фрагментов.
Очевидно, данные процедуры достаточно трудоемки и на большинстве этапов приходится проводить тонкие манипуляции с радиоактивной ДНК, поэтому в настоящее время для определения нуклеотидных последовательностей длинных фрагментов ДНК применяют в основном метод Сэнгера. Для секвеннрования ДНК по методу Сантера ее клоннруют в одноннтевых фагах. Основа метода Сэнгера — синтез радиоактивных копий однонитевой ДНК от фиксированного олигонуклеотида-затравки в присутствии нуклеотндспецифичных терминаторов синтеза ДНК. Чтобы облегчить выделение однонитевых матриц, Дж. Мессингом сконструирована серия векторов на основе фага М13, содержащего в капсидах однонитевую ДНК.
Биология размножения М13 чрезвычайно удобна для создания таких векторов. М13 реплицируется в клетке в виде двунитевой репликативной формы, которую можно легко выделить н использовать для клонирования чужеродной ДНК как обычную плазмидную ДНК. В то же время такие рекомбинантные клоны выделяют и нз суспензии зрелых частиц фага в однонитевой форме. Сконструированные Мессингом векторы содержат полилинкер, т. е. последовательность, являющуюся мишенью для нескольких рестриктаз, для клонирования ДНК в области фагового генома несущественной для его размножения; кроме того, при вставках чужеродной ДНК изменяется цвет фаговых негативных колоний (пятен ливиса на газоне бактериальной культуры) на среде с индикаторным красителем. Для секвенирования олигонуклеотид- 285 о 1- < о < О О.
Ш с Ш 5. х Х 5~ 5. о О О. О х х 51 Д й 5 28б О 5 555 5 595 5 5 Ь 5 о 5 ~- 5 5 5 е "55 й. <$5 + О Ф 5 Ф 5 „* 5~5т, Х <5 ю % о р 5 О й $5 5 5* < 5. 35" 5. Е х с~ <, о 2 5 5 а + < 5 о Ф + 5 Ю 5 О й Ж < с Б х Б О 1О и Я 5. Б < Х а С~ ы < о Ю О \ х О с О— ООИ «< о о о 1- ~- $- «< ооо 1- ~ 3- «< О О О 5. а а Оъ О О о о о о < О О \ а а — Ю о— « оо 1- $- « О О о.
а й ('Ъ о 1 < ! 5. 5. <Ч О О ! о. а затравку длиной 15 — 20 нуклеотидов ренатурируют (гибридизируют) с гомологичной областью фага М!3, лежащей рядом с сайтом, в который встроена клонируемая чужеродная ДНК (рис. 11.15, г(). Можно использовать меченую с 5'-конца затравку или вести синтез в присутствии одного меченого в а -положении нуклеозидтрифосфата. Комплекс матрица — затравка разделяют на четыре порции и наращивают затравку при помощи большого фрагмента ДНК-полимеразы ! Е.
сод (см. гл. 6), всех четырех нуклеозидтрифосфатов и одного специфического для данной порции терминатора синтеза ДНК. В качестве последних обычно используют 3'-, 5!дидезоксинуклеозидтрифосфагы (ИХТР), которые могут включаться в ДНК, но препятствуют дальнейшему росту цепи. В результате включения, например, гЫАТР вместо дАТР в случайные сайты напротив остатков тимина в матрице будет получаться набор меченых олигонуклеотидов с фиксированным 5!концом и оканчивающихся на месте А. Продукты реакции элонгации с ддОТР, с гЫАТР, с ИСТР и ИТТР денатурируют и разделяют электрофоретически, как описано для метода Максама — Гилберта. При автораднографии по- луча(от набор полос, читаемый так же, как набор полос при использовании метода Максама — Гилберта.
Обычно реакции элонгации занимают около 30 мин, что более чем в 6 раз быстрее реакций химической деградации. Скорость накопления информации при этом методе привела к появлению метода секвенирования длинных последовательностей, образующихся в экспериментах типа «зЛо1 ецп» (дробовика). При этом ДНК фрагментируют ультразвуком или с помощью рестриктаз, клонируют полученные случайным образом фрагменты в фаге М!3 и определяют структуру всех этих фрагментов.
Таким образом, секвенируют серию перекрывающихся нуклеотидных последовательностей и с помощью компьютера находят нуклеотидную последовательность исходного фрагмента ДНК. Данный метод в некоторой степени расточителен, так как обычно для выяснения структуры фрагмента длиной 1000 п. н. требуется секвенировать ДНК перекрывающихся фрагментов общей длиной гораздо большей, чем !000 п. н. Разработаны и более экономичные методы генерации серий делетированных вариантов длинной нуклеотидной последовательности, клонированной в фатах серии М13.
Итак, генная и клеточная инженерия целиком возникла благодаря исключениям, наблюдавшимся в риде биологических экспериментов. Эти исключения сами стали основными «правилами игры» в новой области. Широкое использование трансформации зукариот, элементы парасексуального цикла в генетике эукариот, Рис, !1.14. Схема эксперимента по секвеиироваиию фрагмента ДНК по методу Максама — Гилберта. Л вЂ” схема специфической химической модификации нуклеотидов а ДНК; Б — результат злектрофореза в денатурнруюнгем полиакриламидном геле и его интерпретация. Цифры в скобках — длина фрагментов, вмраженнал в числе нуклеотидов Клонируемая ДНК г гу О Олигонуклеогид- -за|равка 5'Р 5' Тпад т Д т ССАТТД 5' ТАССТгМА з АТОСА т тд 5' ТАССТА ПдА АТПСАТ ТА Затравка ПАТР ОСТР ПТТР Рис.
1!.15. Исходная структура однонитевога вектора М13 со вставкой клоннроваиной ДНК и алигонуклеотидом-затравкой, испол»зуемая при секаенирааании по методу Сантера (А). Пунктирная стрелка указывает направление последующего синтеза камплемеятарной пити. Продукты злонгапии затравки в присутствии гЫАТР, останавливающею рост синтезируемой нити в точках, соответствующих А-аленину (Б) культивирование клеток многоклеточных организмов и т. д. объел диняются в систему изменения генетического материала и создания организмов с новыми для них свойствами. Успехи генной инженерии в методах манипулирования генами на основе рекомбинантных ДИК, получаемых ш упго, а также методы клеточной инженерии открывают огромные перспективы в экспериментальной биологии и в создании новых форм организмов, полезных человеку. Мощь этих методов поначалу испугала самих исследователей.
Вот как выразил это Э, Чаргафф в 19"(3 гс «Имеем ли мы право посягать необратимым образом на эволюционную мудрость миллионов лет только для того, чтобы удовлетворить амбицию н любопытство нескольких ученых7»' Прошел, однако, период первого восхищения и растерянности. Генная и клеточная инженерия становятся повседневной рутиной научного эксперимента, используются для селекции продуцентов полезных белков (см. гл, 22) и в медицинских целях (см. гл. 21). Возникла новая область практического использования этих методов — биотехнология. Все очевиднее ста- ' Цит. по: Баев А. А.
Общие представления о генетической инженерии. Итоги науки и техники. М., 1979. ВИНИТИ. Т. 12. Ч. !. С. 7. 288 новятся трудности, которые еще предстоит преодолеть. Стало ясно, что генная и клеточная индсенерия — не панацея, а очередное крупное достижение научной мысли, которое должно быть интегрировано в общую систему знаний. Вопросы к главе /l 1. Перечислите основные свойства генетического материала. В чем они проявляются? 2. Сопоставьте генетические процессы, идущие в гибридных соматических джеках.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
