С.Г. Инге-Вечтомов - Генетика с основами селекции (1117682), страница 50
Текст из файла (страница 50)
Генно-инженерное конструирование у дрожжей пошло по пути создания кольцевых плазмид с центромерами, а затем искусственных мини-хромосом, имеющих центромеру, теломеры и репликаторы (см. гл. б). Таким образом, трансформация эукариот облегчается созданием векторов с репликаторами, специфичными Рис. 11,10. Опухоли, вызываемые А. (клее)ис1елт иа коряеплоле (А) и стеблях (Б) релиса (фото А. А. Войлокоаа) 273 для трансформируемого объекта. Так, высокая эффективность трансформации 2). те1алояаз(ег по гену гу — газу (у мутантов дефектна ксантилдегидрогенеза и глаза приобретают коричневатый цвет) была достигнута путем введения доминантной аллели гу в один из мигрирующих элементов — Р, который составляет часть системы гибридного дисгенеза (см. гл.
10). От 20 до 50 % потомства мух, которым инъецнровали такую ДНК в гониальные клетки, оказались трансформантами гу . Для клонирования генов и трансформации клеток животных перспективными векторами служат вирус БЧ40 и вирус папилломы. Эти вирусы вызывают злокачественные опухоли у грызунов. Кроме того, ВЧ40 может заражать клетки обезьян и человека. Некоторые участки ДНК этих вирусов, составляющей 3,3 — 3,5 МД, могут быть делетированы без потери инфекционности и замещены на фрагменты чужеродной ДНК.
Такие векторы применяют для клонирования генов в клетках животных. 11.8. Генная инженерия в природе и векторы для клонирования генов растений Опухолевое заболевание растений, известное как корончатый галл (рис. 11.10), описал еще Аристотель. В начале нашего века Е. Смит и К. Таундсен (1907) показали, что вызывает это заболевание почвенная бактерия. Выделенная в виде чистой культуры АугоЬасгег(ит Гите)ас(елз способна приводить к образованию опухолей у некоторых представителей голосеменных и большинства двудольных покрытосеменных растений. Клетки растительных опухолей интенсивно растут на искусственных средах и при этом не нуждаются в добавлении фитогормонов в отличие от клеток нормальных тканей. В 70-х годах выяснилось, что причиной опухолеобразования являются так называемые Тг'-ллазмиды, обнаруженные в клетках некоторых штаммов А.
(ите)ас(елз. Т(-плазмиды — это кольцевые молекулы ДНК размером 50 — 80 мкм с молекулярной массой около 1,3 1О Д длиной до 200 тыс. п. н. Эти плазмиды проникают из бактерий в клетки растения, и часть ДНК Т)-плазмиды, так называемая Т-ДИК, ковалентно встраивается в хромосомы инфицируемого растения. Будучи интегрирована с хромосомой, Т-ДНК вызывает образование опухоли, гиперпродукцню фито- гормонов. "цигокииинов и индолилуксуеной кислоты (ауксина), а также синтез ряда производных аминокислот, объединяемых под общим термином олины. Опухоль возникает вследствие нарушения баланса фитогормонов, от которого зависит нормальный морфогенез растения. Опины, выделяемые клетками опухоли, бактерия использует в качестве источников углерода н азота, причем только в том случае, когда А.
(ите(ас(елз содержит Т(-плазмиду, заразившую клетки растения (рис. 11.11). Т)-плазмида относится к классу коиъюгативлых ллазмид, т. е. может передаваться в клетки А. (ите)ас(елз, лишенные ее. Т!-плмк ла Т-ДНК оппт» .л;) — — Каро а ыа рп с м днк я, и стас!еле Тра сфлркпрсеалпан растптеп ел клетка Т-ДНК Яфеамиттпм папеастем Рис. 11.11. егенетическая колонизация» высшего растении бактерией А.
Гига«/астелз (по М.-Д. Хиатон, 1983!. А — А. !игле)астелз существует в ризосфере растения; Б — в клетках бактерии наряду с хромосомой содержится Т1-плазмида; В— Твплазмида проникает в клетку растения и Т-ДНК тктраивается в тоном растения; г — зто приводит к образованнее опухоли и синтезу опинов Этот процесс эффективно происходит в зараженном растении и стимулируется опинами.
Описанные здесь взаимоотношения А. (инге)ас!егхт и высшего растения Дж. Шелл назвал генетической колонизацией, которая представляет собой эксперимент по генной инженерии, поставленный самой природой. Таким образом, Тг-плазмида — это природный вектор для трансформации клеток высших растений. Как показал Дж. Шелл, если из клеток корешков табака с интегрированной Т-ДНК получить культуру (каллус) растительной ткани, а затем целые растения-регенеранты, то при последующем генетическом анализе признак «присутствие Т-ДНК» обнаруживает менделепское расщепление.
В качестве векторон для клонирования генов и последующей трансформации растений используют две разновидности Т1-плазмид. Они различаются по типу опинов (октопины или нопилины), которые синтезируют зараженные ими растения (рис. 1!.12). Клонируемый ген встраивают вместо кодирующей части генов октопинсинтетазы или нопалинсинтетазы, входящих в состав Т-ДНК.
Для клонирования гена в бактерии, обычно Е. со(1, конструируют гибридные плазмиды. После заражения растения плазмидой ее Т-ДНК со встроенным геном интегрирует с хромосомной ДНК. В настоящее время выделены и проклонированы несколько десятков генов высших растений, в том числе гены, контролирующие запасные белки: сои, ячменя, гороха, кукурузы, а также некоторые гены, контролирующие активность ферментов: алкогольдегидрогеназы и каталазы кукурузы, а -амилазы ячменя; некоторые гены хлоропласта пшеницы, шпината и др, Первыми чужеродными генами, введенными в начале 80-х годов в высшие растения, были гены устойчивости к антибиотикам 28! им за Га Гпа /А 60 Глл Оо 100 И ну~ СИН(сну)зСНСООН „НФ МН СН31НСООН нн СМН(СН,)лсНСООН НФ НН ноос(сн ) снсоон ! Ок\овн Нова мм из Е. сод.
Так, в клетки табака был передан ген устойчивости к луегатрехсату — ингибитору дигидрофолатредуктазы. В табак был введен также ген дрожжей, кодирую(ций илкогольдегидрогеназу. Этот ген устойчиво наследовался в мейозе у растений-регенерантов, полученных из каллусной ткани, но не экспрессировался в клетках растений. Ген, кодирующий (.' глобин кролика, удалось интегрировать в геном табака. Он устойчиво наследовался в культуре каллусной ткани, но опять же не экспрессировался. В клетки подсолнечника с помощью Т1-плазмиды был передан ген фвзеолина бобов.
Фазеолин — это гликопротеин, составляюший 'до 50 оу', запасного белка бобов. Будущее растение, полученное первоначально в виде каллусной массы, получило наименование сандип (от обьединения англ. названия подсолнечника— иапйоцег и бобов -- Ьеагз). Тот же ген фазеолина введен в табак и получены растення-регенеранты, синтезирующие менее ! % фазеолина от общего белка растения. Получены растения табака, которые светятся в темноте благодаря экспрессии в них гена люциферазы светлячка.
Это лишь первые шаги генной инженерии растений. Рис. 11.1Х тг-плазмнлы (по Дж. Шеллу, 1983). А — - актапииаиал(  — напалиноиан. Гомологичнме участки (о — оз заштрнхозанм. Показами генц сммтегиж Оса -- октопина, ауж — нопалнна; «лткролмзмкг Лгу — аргинима, Осе — охтинниа, АМ вЂ” агропииа, Алев агроцинопнн»; Угм — функции переноса при «омъмгации, улс — несозместимести с другими плазмндами, Оп' — начало репликзции 11.9. Рестрикционное картирование и секвенирование Установление точек действия различных рестриктаз позволяет проводить 4изическое картироваиие участков молекулы ДНК и небольших геномов (плазмид вирусов).
Распределение сайтов рестрикции представляет собой своеобразный паспорт каждого фрагмента ДНК и может быть использовано для его идентификации. Принцип рестрикционного картиронанил сводится к получению перекрывающихся по размеру фрагментов, которые разделяют при помощи электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. Молекулярную массу фрагментов обычно определяют, используя в качестве «свидетеля» ДНК известного размера. На электрофореграмме рестрикты-фрагменты ДНК различают, окрашивая их бромистым этидием и просматривая гель в ультрафиолетовом свете.
Применяют также радиоактивное мечение концов фрагментов с помощью полинуклеогидкиназы фага Т4. Непосредственно для картирования сайтов рестрикции используют метод неполного гидролнза одной рестриктазой или метод нескольких, чаще всего двух рестриктаз. В случае неполного гидролиза молекулы, имеющей, например, два сайта рестрикции, будут получаться пять фрагментов — пять полос при электрофорезе плюс еще одна полоса интактных молекул (рис. 11.13, А). В простейшем случае по распределению молекулярных масс удается определить взаимное расположение фрагментов.
Можно также извлечь из геля продукты неполного гидролиза и еще раз подвергнуть их действию рестриктазы. Если при этом (см. рис. 11.13, А) освобождается общий фрагмент В, то общее расположение фрагментов определяется: АВС. При использовании двух рестриктаз ДНК гидролизуют каждой рестриктазой по отдельности и обеими рестриктазами вместе.
Предположим, что одну и ту же молекулу одна рестриктаза режет Рп,р .ыы! А 1 В т С гас р а.ын ';"Рч;т ( А ! рлслралали«е >л с а али ероам сраыче ~р е орлом . лро * ДНК Л А в с л в в а л 2ЯЗ Рис. 1!.)3. Физическое картироаание молекулы ДНК методом неполного гилроли- за (4) и методом двух рестриктаз (о) (по Н. И. Матвиенко, 1979). Фрапеситы А, В, С образ!меси при ле Рсткии рсстриктазы 1; А', В' при лейстаии рестрик- тазы )! на два фрагмента, а другая — на три (рис. 11.!3, Б). При совместном их действии исчезает фрагмент В и появляются два новых, по молекулярной массе в сумме составляющих исчезнувший фрагмент. Таким образом, сопоставляя размеры фрагментов, выявляемых на электрофореграммах а, 6, в, определшот их взаимное расположение: АВС. Если физическое картирование сделано для участка генетического материала, маркированного мутациями с известным расположением, то рестрикционную (физическую) и генетическую карты можно ориентировать относительно друг друга (см.
гл. 16). Революционизирующее значение для работы с генетическим материалом имели методы определения первичной структуры, или секвенирования ДНК (от англ. зейиепсе). Современные методы сехвениронянил (метод химической деградации ДНК Максама — Гилберта и метод синтеза ДНК на матрице в присутствии терминаторов синтеза Сэнгера) в своей основе разработаны в 1977 г. Идея методов состоит в следующем: 1. Получение серии меченных радиоактивными изотопами полинуклеотидов с одним фиксированным концом и заканчивающихся по одному из четырех нуклеотидов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
