С.Г. Инге-Вечтомов - Генетика с основами селекции (1117682), страница 54
Текст из файла (страница 54)
12.3). В то же время метод отпечатков незаменим при учете мутантов, теряющих способность к росту на каком-либо субстрате, например ауксотрофных по гнстидину. Тогда колонии, выросшие на полноценной среде, перепечатывают на чашки со средой без гистидина и отыскивают те, отпечатки которых на этой среде не способны к росту. Затем сравнивают их частоты в контрольном и опытном вариантах.
Сложнее определить частоту спонтанного мутирования. Число мутантов, встреченных в контрольном варианте, обычно прямо не отражает частоту мутирования, а лишь показывает концентрацию мутантов, которые могли некогда возникнуть и размножиться в культуре. Как определить истинную частоту спонтанных мутацийу Современные методы определения частоты спонтанного мутирования представляют собой модификации подхода, использованного С. Лурия и М. Дельбрюком (1942). Эти авторы впервые исследовали распределение числа мутантных клеток в параллельных клонах — бактернальных культурах. Рассмотрим один из вариантов определения частоты спонтанного мутирования на конкретном примере исследования мутаций: Аг(е" — Аг(е" у мутанта по гену аг(е2 дрожжей-сахаромицетов. Этот пример удобен тем, что колонии, образуемые исходной культурой, красные и нуждаются в аденине.
Мутанты же (в данном случае ревертанты) белые и Исходнатг суспензия Е, сон Мутаген Среда Среда Среда Среда без бактериофага с бектериофагом без бак~ериофага с бактериофагом Рнс. 12З. Учет частот~а мутантов Е. сод, устойчивых к бактериофагу, методом прямого рассева в аденине не нуждаются. Это позволяет для выявления мутантов применять селективный метод. Прежде всего нужно узнать распределение спонтанных мутантов среди клонов, содержащих одинаковое число клеток.
В данном случае удобнее всего использовать предложенный Н. Н. Хромовым-Борисовым метод упорядоченного посева на среде, полуобогащенной ограничивающим фактором роста. 299 Капли суспензия исходной культуры равного объема наносят специальным реплнкатором на плотную среду, содержашую количество аденнна, необходимое для несколькнх делений клеток ас(е 2. Благодаря тому, что штыри реплнкатора (рнс. 12.4, А) расположены в углах правильной тригональной решетки, все колонии оказываются на равном расстоянии друг от друга н имеют одинаковый размер, а следоаательно, н число клеток. Варнабельность не превышает 1 ош После прекрашення роста колоний нз-за нстощення аденнна в среде на ннх появляются колонии вторичного роста, илн «бородавки» мутантов Ас(е'.
Онн образуются в результате продолжающихся делений мутантных клеток, не нуждающихся в аденнне. Белые бородавки Аг(е хорошо заметны на фоне красных колоний Ас(е (рнс. 12.4, Б н В). Тогда частоту мутаций (т) в пересчете на клетку за одно клеточное деление вычисляют по формуле лг = (Х- (л 2) /%, где )( — среднее число бородавок на одну колонию, М вЂ” среднее число клеток в колонии. Ту же задачу можно решить н другим способом.
Поскольку спонтанные мутации — события редкие, распределение мутантов по колониям соответствует распределенню Пуассона. Если нзвест- Репликатор Суспензил клеток ес)е 2 Минимеллнал среда. полуобогашеннап еленином Рис. !2.4. Определение частоты спонтанного мутирования Аде У-н Аде» у штамыа дрожжей, мутантного по гену аг)е2. А — общая схема эксперимента. После инкубапни отпечатка на среде, полуобогащенной аденином, вырастают красные колонии. На некогормх иэ них белые ебородавкит — колонии вторичноео роста— мутанты; Б — общий вид чашки Петри со средой, полуобогащенной аденином, на которой выросли колонии (упорядоченный посев) Агре 1»идны «бородавки»вЂ” мутантные колонии вторичного роста — белые);  — увеличенный фрагмент той же чашки (по Н.
Н. Хромову-Борисову> ,,-Ф е е а ~'Э' е е'' е Ф а=,,:;.;в е в е е а е в '"ф Ф Ф '..Ф .'Ф Ф Ф' в е .Ф Ф .Фа Ф' Ф в. Ф. в ее е Ф а е а е в,,' в а е ''е 'е.а Ф, Е - Е Вз',Еа в в е, е. '"е.'. е а Ф Ф Ж~ в,.е., в в е!„. Ф,,Ф, Ф е:.,ф~ Ф 'Ф' .'Ф Ф .Ф е. а е в в.. Ф, е в „!~-'Ф., "' В Ф,,Ф „:Ф Рис. ! 2.4.
Г!роаалжение. 30! на доля колоний, вообще не содержащих мутантов, Ро, то !ОР„= — Х, где Х вЂ” среднее число мутаций на колонию. Тогда, зная среднее число клеток в колонии 1)У), определим т как и в предыдущем случае: т = (х. 1п2) ))!). Этот второй подход применим и к вычислению частоты спонтанных мутаций в параллельных жидких культурах, где мутантные клетки возникают, делятся и перемешиваются так, что непосредственно узнать число независимых мутационных событий невозможно. В этом случае Р„ будет соответствовать доле параллельных культур, заложенных из одной суспензии и не содержащих мутантов. Естественное условие такого эксперимента — отсутствие мутантов в исходной суспензии клеток.
Определить частоту спонтанных мутаций можно и по распределению мутантных клеток между параллельными культурами. Однако это требует более сложных вычислений. Частоты спонтанного мутирования у микроорганизмов представлены в табл. 12.1. Таблица 12.1. Частота спонтанного мупврованна некоторых генов у различных организмов Частота мутв. цнй на геном за генерацию Частота муга цнй на геном за генерацию Организм (признак) Организм (признак) 3.10-9 1 ° 10 ' 4 10-»в ! ° !о " 2 10 " 3 10'" 1 ° 10 2.!О ' 2.10"в 1-10 ' 4.10-» !О-в ! ° 10 " 1 ° 10 '" 210» 2.10 ' 4 ° 10 1 ° 10"' 3!О' 1,5 1О ' 3 10 "» 5 10 ' 1 ° 10' '" 3 10'" 3.10 ' 3. 10' ' 1 ° 10» Бактериофаг Ту Круг хозяев Подавление ливиса Взсйепсыа сой Устойчивость к стрептомицину Зависимость от стрептомнцина Чувствительность к фагу Т( Устойчивость к фагу Т( Усвоение галактозы Ферментация лактозы Потребность в гнстиднне Восстановление прототрофности по гистидииу Яи!и))те))а )ррытиг1ит Восстановление прототрофностц по триптофану Чувствительность к стрептомипииу Я)арйносогсиз аигги Чувствительность к сульфатназолу СЛ)оглу))оп)опаз гетЛаг»()и' Устойчивость к стрептомицнну Л»си»отрога стима Восстановление про.
тотрофности по аденину Восстанонление прототрофности по инозиту Веа )лайз Морщинистые семе. на Пурпурные семена Сахарный зндосперм Оговора»!а те)апойаз!ег Белые глаза Желтое тело расщепленные ше. тинки Вырезка на крыле Коричневые глаза Л!из тг»зси!и» Коричневая окраска( Альпинизм Пегость Драло гзсение табл. /2.1 Частота муга. пнй на геном за генерапию Частота муга. пий па геном за генерапию Организм (признак) Организм (признак) 3.10 '" 4 810 з Гемофилии А Ахоидроплазия (карликоность) Нейрофиброматоз (опухоль нервной ткани) Альбинизм Микропефалия Ослабленная окрас. ка Ното заргепз Аниридия (отсутствие диафрагмы) Ретинобластома (опухоль сетчатки) 3 10 ' 8.10 в 2 1О ' 3 ° 10 з 3 ° 10 з 1 ° !О '" П р и и е ч а и и е.
Здесь поиитие «генерааниз соответствует ренликапин генома (одно деление) дли «зеток и вирусов и олному половому поколению длн миогоклеточных. ЗОЗ Учет лтутаций у дрозофнлы. Изучение мутационного процесса, особенно спонтанного мутирования у высших организмов — растений и животных — затруднено в связи с ограниченным числом особей, которых можно исследовать, а также в связи с их диплоидностью, препятствующей непосредственному проявлению рецессивных мутаций. Наиболее удобные методы учета мутаций разработаны для дрозофилы (Р. ше1алояах(ег).
Собственно именно создание методов учета рецессивных летальных мутаций в Х-хромосоме определило успех Г. Меллера, открывшего действие рентгеновых лучей на мутационный процесс у дрозофилы. Для учета рецессивных летальных мутаций, сцепленных с полом, у дрозофилы широко применяют метод Меллер-5 (рис. 12.5). Самки линии Меллер-5, или М-5, несут в обеих Х-хромосомах по две инверсии: зс" и 6 49. Инверсия зс" захватывает почти всю Х-хромосому, а в ее пределах находится еще одна инверсия — 649. В этой системе кроссинговер полностью подавлен. Используемые инверсии не имеют рецессивного летального действия.
Кроме того, обе хромосомм М-5 несут три маркера: два рецессивных — и"' (абрикосовый цвет глаз) и зс" (укороченные щетинки — фенотипическое проявление одноименной инверсии, затрагивающей ген кс) и один доминантный — Ваг. При скрещивании исследуемых самцов с самками М-5 в индивидуальных семьях Г, получают по два класса самок и самцов, если в Х-хромосоме сперматозоидов исходного самца не возникла рецессивная летальная мутация (рис. 12.5, л). Если же рецессивная легаль появиласиь то в соответствующей индивидуальной 4 Р а в х иа в , а в Е г туа в тта ДД(иаВ и и~+Вт ~~;теаВ и и+В; Х-лучи иа в Р 9 в Е в а в уу; ав и и'В Рис. КЬ5.
Метла Меллер-5 лля учета рецессивных, сцепленных с полом летальных мутаций у О. теылоапнеп Рецессивная летальная мутация (П; А — отсутствует;  — появилась культуре в Рт мы получим только один класс самцов (рис. 12.5, Б), будут отсутствовать самцы дикого типа и" 8". Метод Меллер-5 можно использовать и для регистрации рецессивных мутаций в Х-хромосоме с видимым проявлением. Для этой цели удобнее применять метод ИоиЫе уеИои', основанный на скрещивании исследуемых самцов с самками, несущими сцепленные Х-хромосомы (см.
гл. 5). Благодаря тому, что при таком скрещивании сыновья получают свою Х-хромосому непосредственно от отца, рецессивные мутации в этой хромосоме можно учитывать уже в Р~ (рис. 12.б). Х.пучн Обычно гибнут Рис. 12,<>. Использование мен>да дооме уе1!отч длв учета редессивныл мутадий в Х-хромосоме с видимым проваленном в р у дровофилы Учет летальных мутаций и мутаций с видимым фенотипическим проявлением легче удается для Х-хромосом дрозофилы благодаря специфике ее наследования, Однако существуют методы учета летальных мутаций е аутосолгах. Например, для учета рецессивных летальных мутаций в хромосоме 2 используют так называемый метод сбалансирован>тых деталей, Для этого применяют линию, гетерозиготную по хромосоме 2.
В одном гомологе находятся доминантные гены Су<1у (Су — загнутые крылья) и Х.обе ( т'. — уменьшенные глаза лопастной формы), в другом гомологе — Р1ит (Рлт — сливово-коричневый цвет глаз). Кроме того, хромосома Су с. содержит инверсии, препятствующие кроссинговеру. Все три доминантные мутации обладают рецессивным летальным действием. Благодаря этому при разведении такой линии выживают только гетерозиготы по указанным генам.
Это и есть система сбалансированных леталей. Для изучения рецессивных летальных мутаций, а также рецессивиых мутаций с видимым проявлением исследуемых мух скрещивают с мухами Сут./Рлт. В Р! получают мух, гетерозиготных по той или другой хромосоме исследуемой линии, и индивидуально вновь скрещивают сегрегантов Суа. с мухами Су(.<Рт. В Ра (в индивидуальных культурах) скрещивают между собой самцов и самок с признаками Суд. и анализируют Ра (рис. 12.7). В отсутствие рецессивной летальной мутации расщепление в Р» будет 2СуЛ: 1Су е.
(рис. 12.7, А), а если в половых клетках мух исходной линии возникали летальные мутации, то в соответствующих индивидуальных культурах в Ра не будет нормальных мух 2Сут'.: О Су т'.' (рис. 12.7, Б). Аналогично учитывают в Е>> и рецессивные мутации с видимым проявлением в хромосоме 2. 4 Р Су х Су С СР Е гС~И: 1 Су'~' Х.пуни Су 2 Су й Су й Р :; =",' —... Ф гСИ,:о с~+у + Рнс. !2.7. Метод сбаяансированных леталей по хромосоме 2 дрозофилы для учета в иих рецесснвиых мутаций. А — мутации не возникли; о -- в хромосоме 2 возникла рецессивная летальная мутация ооооо ооооо ооооо ООООО ООООО ооооо о оооо ооооо ООООО ООООО ООООО ООООО т'т Сампо раст о о о оо оо ооо оо ооо о о о оо ооооо оо ооо о о о оо о о оозооо о о оооооо о о о ооооо О Е ОООЕОО о о оооооо о о ооооое о о оооооо Группы семей тез, соответствующие исходным евтостернпьным растениям Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
