С.Г. Инге-Вечтомов - Генетика с основами селекции (1117682), страница 49
Текст из файла (страница 49)
В качестве векторов служат плазмиды, несущие гены устойчивости к антибиотикам. На первых этапах развития генной инженерии применяли естественные плазмиды Е. со(1, например ра!101 или Со!Е1. В настоящее время работают с искусственными рекомбинантными плазмидами, которые несут два или три гена устойчивости, в которых содержат по одному уникальному сайту рестрикции для какой-либо рестриктазы.
Это плазмиды рвк322, 324, 325 и др. Например, широко распространенная плазмида рВВ322 772 Ата ! Ваги Н1 Ве( И Есо й! Есо й1! Есо й!* Нас !! Нра! Н1лб !И Н!л(! Нра !1 МЬо! Рз! 1 5а! 1 Тац ! ХЬа 1 ХЬо 1 Хгпа 1 С(РуССгРнгэ Сг(СгАТТС А1ОАТСТ СттААТТС Т гААТТ РпСгССэС(Ру СС61С А1АОСТТ Сг г АНТС С1ССтгэ 1СэАТС СТОСА!О О'ТССгАС Т(ССгА ТтСТАСэА С1ТССэАОэ С(СССггзгг с Ы ) кшчц о 4 44~ л ~\ дт е о оо "Ьо в, "е ул ееп 9% ц ))ае ДМ) Вй)1 о )1 ев со Р а е Рис. 11.1. Структура плазмидм рнвйг2. На внешнем крусе показаны различные сайтм рестрикции )цифры — единицы измерения молекуяярной массы в! 'л 10'Д), на внутреннем — расстоянии в тысячах пар нуклеотидов. Лр' и ГК вЂ” устойчивость к ампицнллину н тетрациклину соответственно, Оят — начало реплияацнн 213 (рис.
11.7) несет гены устойчивости к ампициллину (Ар') и тетрациклину (Тс'). В гене Ар" находится уникальный сайт для реетриктазы Рй(1, а в гене Тс' — для ВашН1. Вскрывая вектор рВВ322 по сайту ВашН! в гене Тст, в него можно встроить фрагменты, полученные при помощи той же рестриктазы за счет взаимодействия липких концов. Ковалентное соединение вектора и клонируемого фрагмента завершает полинуклеотидлигаза ш уйго или Ш У)УО. Если теперь трансформировать клетки компетентной культуры Е.
со0 плазмидой рВВ322 со встроенным в нее фрагментом, то трансформантов можно отобрать на среде с ампициллином. Далее необходимо их проверить по признаку устойчивости к тетрациклину. Если исходная клетка была трансформирована интактной ДНК вектора присоединение Есоян — линкера Соединение липким концов 274 Клонируеман ДНК плазмидой — без встав- ки фрагмента, то транс- ! формант будет устойчив Фрагментация к тетрациклину так же, з как и к ампициллину.
Если же трансформа! Есо Л! ЦИЮ ОСУщЕСТВИЛа ПЛаэмида со вставкой фрагмента в ген ТС, трансформант должен быть чувствителен к тетрациклину, поскольку ген Тс" оказался разорван и инактивирован вставРас<цепление Есол! кой. Далее клонируемый Юани в фрагмент ДНК может быть неограниченно размножен в ходе клеточных делений трансформанта. Векторы типа плазмиды рВВ322 называют векторами инактивации.
Широко применяют также векторы на оси<нее бактериофаги А. ИзвестРис. <!л. Испол»ховали« синтетических линк«ров но, что средняя часть телла образованна липких концов и встраивании нОма л не существенна фрагмента в вектор для его литического размножения в Е. сой и может быть заменена на чужеродный фрагмент ДНК. Если размеры получаемой прн этом ДНК не превышают предела (не более чем на 10 ";,'), допустимого лля упаковки в частицу фага, то образуются фаги с чужеродными фрагментами ДНК. В этом случае клоиируемый участок ДНК хранят в виде частиц бактериофага или в виде клона бактерии с интегрированными гибридными профагами.
Существует множество типов векторов, сконструированных на основе различных плазмид и различных бактериофагов. Не всегда удается получить фрагменты ДНК с липкими концами. Эти концы могут быть «пришиты» к фрагментам ДНК искусственно, если ДНК получена при помощи рестриктазы, образующей «тупые» концы, или в результате гидродинамической фрагментации. Одну цепь таких молекул с тупыми концами наращивают за счет олигодезокси-А, а другую — за счет олигодезокси-Т при помощи нуклеотидилтринсферизы, Тупые концы наращивают также за счет синтетических линкеров — последовательностей, «узнаваемых» определенной рестриктазой нли несколькими из них (рис.
11.8). После обработки соответствующей рестриктазой концы становятся липкими и фрагмент можно встроить в вектор, вскрытый той же рестриктазой. 1!.6. Банки генов Рассказывая о клонировании фрагмента ДНК, мы подразумевали, что нам доступен искомый ген или известна молекулярная масса фрагмента, который можно извлечь из электрофореграммы рестриктов ДНК. В действительности для получения нужного гена чаще всего необходимы поиски, и порой достаточно сложные.
Для этого геномную ДНК, разрезанную выбранной рестриктазой, смешивают с ДНК вектора, вскрытого той же рестриктазой по уникальному сайту. В результате взаимодействия липких концов н последующего лигирования получают смесь рекомбинантных ДНК. После этого полученные плазмиды со вставками различных участков ДНК необходимо расклонировать. Для этой цели описанным способом проводят трансформацию Е. со(й Поскольку трансформацию осуществлякгг смесью плазмид с разными вставками, то различные клетки в результате трансформации получат разные фрагменты клонируемой ДНК.
Следовательно, на этом этапе нужно собрать как можно больше клонов трансформантов, чтобы быть уверенным в том, что искомый ген находится в одном из клонов. Так создают банки генов, порой состоящие из десятков и сотен тысяч клонов трансформантов. Размеры банка, необходимые для полного клонирования того или иногх> генома, можно определить, зная молекулярную массу генома (М), средний размер клоиируемого фрагмента (т) и задавая определенную вероятность (Р) того, что клонирован весь геном.
Тогда объем банка, т. е. число клонов (1«'), равен: )чг = — (п (! — Р). М Для некоторых объектов размеры банков генов представлены в табл. (!.2. Теперь можно приступить к поискам интересующего нас гена. Если проклонирован геном Е. со(г', то процедура сводится к «нара- Таблица 11.3. Рознер бенке ~снов (И) рвзнмх оргвннзмов, содержвшего нскоммй ген с рвзлнчной верон«но«тою (р) (нз Н. И.
Матвиенко, оо С!вгйе о. Евгьон, г976) 275 Рм! — фрагменты Объелинение по липким концам Лигнроеанне и трансформация Е.соб © «ф~с.согг 1банк генов1 Рис. 11.9. Общая схема получения банка генов на основе платмиды рВк 222. ()тбирают колонии трансфорнантогь сохранившие устойчивость к тстрапиклнну, но утратившие устойчивость к анппциллиьу 276 ботке» клонированных фрагментов ДНК и проверке их способности трансформировать соответствующие мутанты Е.
со(1. При этом необходимо иметь достаточно стабильный рецнпиент для трансформации, т. е. частота его ревертирования по заданному гену должна быть значительно ниже частоты трансформации. Кроме того, используемая в работе рестриктаза могла инактивировать искомый ген, если в нем был соответствующий сайт рестрикции. Поэтому может потребоваться повторение всей процедуры с другой рестриктазой. Общая схема эксперимента по клонированию геномной ДНК представлена на рис. 11.9.
На практике применяется неполное переваривание геномной ДНК одной или смесью двух рестриктаз. 11.7. Трансформация эукариот Значительно сложнее отыскать какой-либо ген в банке генов 1). ше!анояаз(ег. Для этого лучше всего точно знать, что представляет собой генный продукт. Если это фермент, то следует выяснить, какую реакцию он контролирует.
Если ген экспрессируется в клетках Е. со(1, что маловероятно (см. гл. 1б и 20), то можно считать, что экспериментатору повезло. В этом случае искомый ген идентифицируют по способности компенсировать соответствующий дефект метаболизма у мутанта Е. соя. Поскольку гены эукариот обычно не экспрессируются в клетках прокариот, прибегают к иным методам. Используют иммуиохимические методы, в частности моноклональные антитела, если белок (генный продукт) доступен и им можно иммунизировать животных. Для идентификации несущих ген клонов ло гибридизации ДНК вЂ” РНК используют также меченную радиоактивными изотопами иРНК.
При поисках определенного фрагмента в банке генов лучше всего идентифицировать его по способности трансформировать соответствующие мутанты того организма, геном которого был клонирован. При трансформации эукариот при помощи ДНК бактериальных плазмид необходимо учитывать, что репликаторы бактерий и их плазмид не работают в клетках эукариот. Вследствие этого такая трансформация низкоэффективна.
Для того чтобы возник стабильный трансформант, необходимы два последовательных события: проникновение ДНК в клетку и ее рекомбинация с хромосомной ДНК, т.е. интеграция. Такую интегративную трансформацию легче провести у эукариотических микроорганизмов, для которых доступны методы селективных сред, чем у многоклеточных эукариот. Именно так были проведены первые эксперименты по трансформации дрожжей засей. сггегшаг. Для этого дрожжевой ген ЕЕ(12, кодирующий ()-изолролиггиалагдегидрогеназу, был вставлен в бактериальную плазмиду Со!Е1 и проклонирован в Е.
сод. Этот ген Засей. сегег(г(ае экспрессируется в Е. со(1, компенсируя аналогичный метаболический дефект бактерии. Сфгропласгы дрожжей (клеткн, лишенные оболочки) трансформировали 277 плазмидной ДНК. Реципиентом служил штамм, несущий стабильную мутацию ьеи2. Частота трансформации составляла 1)( 10 ' на регенерирующий сферопласт, т.е. на число клеток, которые вновь восстановили свою оболочку. Повысить эффективность трансформации на два порядка удалось с использованием так называемой челночной или гибридной ллазмиды, имеющей два репликатора: один — от Со!Е! (бактериальиый), а другой — от дрожжевой плазмиды размером 2 мкм (см.
гл. 10). В дальнейшем в таких челночных векторах использовали репликаторы ДНК длиной 3 мкм (см. гл. 10) и АВ8 — последовательности, обеспечивающие репликацию хромосом (см. гл. 6). Такие векторы могут реплицироваться как в Е. со((, так и в Заест(. сегер(з(ае. Повышение эффективности трансформации такими эписомными векторами сопровождалось высоким уровнем нестабильности трансформантов. При клонировании трансформантов в неселективных условиях 70 — 80 о(', клеток теряли плазмиду и, соответственно, вновь становились ауксотрофными по лейцину. Причины этой нестабильности и способы ее преодоления пока неясны. Находясь в клетке, такие эписомные векторы могут интегрировать с хромосомной ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
