С.Г. Инге-Вечтомов - Генетика с основами селекции (1117682), страница 48
Текст из файла (страница 48)
11Д. Схема получения монохлональных антител на основе гибрндои (по С. М. Гершензону, 1рб31 Удается не только слияние соматических клеток, но и реконструкция целых клеток из их отдельных компартментов. Так, можно энуклеировать клетки млекопитающих„воздействуя на них цитохалазином  — веществом, которое вырабатывает гриб Не(- тт(лохропит Ыеша((о(аеас.
Цитохалазин вызывает выталкивание ядер нз клеток. В результате такой обработки образуются безьядерные клетки — цитопласты и свободные ядра, окруженные тонким слоем цитоплазмы, — кариопласты. Цитопласты можно сливать с нормальными клетками, получая ядерно-цитоплазматические гибриды, или циориды. Этот метод — аналог цитодукции для соматических клеток млекопитающих и позволяет изучать взаимоотношения ядерных и неядерных генов. Таким способом была продемонстрирована митохондриальная природа устойчивости к хлорамфениколу у соматических клеток мыши.
Свободные ядра и цитоплазму удается перекомбинировать у простейших и амфибий. Ядерные эритроциты птиц сливают с энуклеированными клетками млекопитающих при обработке вирусом Сендай. Поскольку при таком воздействии эритроциты лизируются, клетка фактически реконструируется из ядра эритроцита и цитопласта млекопитающего. В результате слияния ядро эритроцита птицы (курицы), ранее неактивное, начинает функционировать в цитоплазме млекопитающего (мыши): синтезируется РНК, появляются ядрышки, иногда наблюдается синтез ДНК. Правда, жизнеспособность таких реконструированных клеток сохраняется недолго — около трех дней.
Получают и реконструированные клетки млекопитающих путем слияния кариа- и цитопластов. В последнее время разрабатываются методы микроинъекций в клетки с помощью «теней» эритроцитое — мембран эритроцитов, лишенных содержимого, или так называемых мембранных пузырьков — замкнутых фрагментов клеточной мембраны, а также других искусственных и природных носителей. Используя подобные носители, в клетку можно вводить лекарства, красители и даже целые хромосомы. Эксперименты по реконструкции клеток открывают новые перспективы как для изучения биологии клетки, так и для разработки новых методов терапии на клеточном уровне.
11.3. Трансформация и генная инженерия Открытие трансформации у бактерий и особенно идентификация ДНК как трансформирующего агента стимулировали попытки трансформации у животных, растений и эукариотических микроорганизмов. При этом попытки провести трансформацию с помощью препаратов тотальной геномной ДНК привели к противоречивым результатам. Только в конце 70-х годов были получены воспроизводимые результаты с применением так называемой векторной трансформации. В основе этого подхода — использование векторных молекул, или векторов, в качестве которых применяли плазмиды сначала 267 бактериальных, а затем эукариотических клеток. Векторы — это молекулы ДНК, способные переносить включенные в ник гены в клетку, где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом. Решающую роль в этих экспериментах сыграли также методы получения индивидуальных генов, наработка их препаративных количеств путем клонирования, т.
е. практически неограниченного размножения в бактериальных клетках. В ходе разработки этих процедур была создана мощная техника генной инженерии, включающая: выделение индивцауальных фрагментов ДНК любого происхождения, их стабильное воспроизведение в составе векторов, идентификация функций клонированных таким образом генов, их изменение и введение в клетки исходного или иного организма. Эта техника, получившая также название техники рекомбинантной ДНК, в соединении с методами расшифровки первичной структуры генов, т.е.
их нуклеотидной последовательности, сделала возможными эксперименты непосредственно на генетическом материале, манипулирование генами в научных и практических целях. 11.4. Получение генов Первый успешный эксперимент по выделению гена, а точнее, группы генов лактозного оперона (см. гл. 17) Е. сой был выполнен в лаборатории Дж. Беквита (1969). Для этого использовали два трансдуцирующих бактериофага А и ц 80, включившие (асоперон в свои геномы в противоположной ориентации по отношению к собственным генам (рис. 11.5). Напомним, что фаги ).
и ц 80 близки по структуре генома (см. гл. 9). У обоих фатов одна цепь ДНК отличается от другой по плавучей плотности. Благодаря этому после плавления ДНК этих бактериофагов тяжелую и легкую цепи можно разделить при помощи центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Если теперь взять только тяжелые цепи ДНК, то благодаря тому, что 1ас-оперон был включен в геномы 2 и 9~ 80 в противоцоложных ориентациях, лишь один участок этих цепей будет иметь комплементарные последовательности оснований. Это участок ДНК 1ас-оперона.
Тогда при гибридизации тяжелых цепей получается совершенный дуплекс только на участке 1ас-оперона, а остальные части цепочек останутся неспаренными (рис. 11.6, А). Их удаляли действием нуклеазы, специфичной к однонитевой ДНК, и таким образом получили ДНК генов лактозного участка Е. сой в чистом виде (рис.
11.6,Ь). Эксперимент Дж. Беквита и других принято считать началом генной инженерии. Поскольку подход к выделению (ас-оперона весьма специфичен для бактерии Е. сой, его сменили другие приемы, применимые в работе с любыми организмами. Главную роль на первом этапе выделения гена отводят эндонуклеаэам рестрикции, или рестриктазам (см. гл. 9). Эти ферменты 26а А У а г ор! и Фа| 2 А' Х' а'у' г'о' р'!' )9 1 з' р' а'з' у'зк я Фаг (6яо Я' !р ог уа дг' (!) разделение цепей А Тяжелая (Н) цепь М' А' У' а'у' г'о'р'з" рр В Тяжелая (Н) цепь я' А' Г зро гу а д!' (2)гнбрнднзацня цепей ()) обработка нуклеазой !' р'о' г' у'а' Частая ДНК лактозного оперона зрозуа рнс. )!.5, Выделение генон лактозного участка (йзс.оперона) Б.
соя (по й Бйар)го ет а!., )969) разрезают ДНК вблизи или внутри определенных последовательностей нуклеотидов (табл. )1.1), которые одинаковы на обеих комплементарных цепях. Два разрыва в одинаковых позициях комплементарных цепей на концах фрагмента образуют так называемые липкие концы, которые могут вновь замыкаться благодаря комплементарности оснований.
Последовательности, узнаваемые рестриктазами, статистически разбросаны по геному. заем короче последовательность, тем чаще она встречается и соответственно тем короче фрагменты ДНК, образующиеся при рестрикции. Фрагменты рестрикции, или рестрикты, можно разделить по их молекулярной массе и заряду при помощи электрофореза в геле. В настоящее время из различных микроорганизмов выделено множество рестриктаз с неодинаковой специфичностью по отношению к нуклеотидным последовательностям ДНК. Отыскание нужного гена среди смеси рестрикционных фрагментов представляет известные сложности, о чем речь пойдет далее, Наряду с этим наиболее распространенным способом получе- 269 рис, ы.о.
дНК 1ис.онерона ои Зьар~го е~ ы„!9оох А — результат снб носледователаносги лахтохного участив. Видны неснаренные однОце ных олноценочечных «хвостов» ния генов существует также способ химического синтеза генов. Методология синтеза ДНК с заданной последовательностью нуклеотидов была разработана Г. Кораной в 60-х юдах, еще задолго до наступления эры генной инженерии, После того как была расшифрована первичная структура первой индивидуальной нуклеиновой кислоты — аланиновой тРНК дрожжей, Г. Корана с сотрудниками синтезировал химическим путем кодирующую часть гена для этой РНК размером в 77 и.
н. В дальнейшем в 1976 г. в той же лаборатории был синтезирован геи тирозиновой тРНК Е. соб, который работал, будучи введенным в геном бактериофага Т4, в клетках кишечной палочки. Методология, разработанная Г. Кораной, широко применяется для синтеза целых искусственных генов, например генов челове- 270 ридиаацнн тнжелых цепей Х и т 80, содержащих комллементарные почечные»акосты»; Б — дуплекс (аснеион, осаобожаеиный от несларен- ческого гормона ннсули>ш, вводимых затем в бактериальные или дрожжевые клетки-продуценты.
В настоящее время существуют автоматы для синтеза ДНК заданной последовательности. Те же подходы применяют для синтеза так называемых ДОК-зондост, т. е. небольших участков генов (20' — ЗО и, н.). Это возможно, если известна хотя бы часть первичной структуры нужного белка. Тогда, пользуясь таблицей генетического кода (гл. 16), можно вывести структуру соответствующего участка гена. Такие зонды используют лля поисков нужной комплементарной им иРНК. Выделенную при помощи зонда иРНК используют затем лля синтеза так называемой кДНК (комплементарной ДНК) с помощью фермента обратной транскрилгазы, о которой упоминалось в гл.
10. Таблица 11.1. Некоторые эндонуклеазы рестрикции — рестриктазы, обрааующие фрагменты с ливками концамм (нз В. И. Танащнна, 19791 узнаваемый участок (б' — 3') Могут соединяться с фрвгментвмп, обрвэоввннымя Фермент 5а11, ХЬо 1, Хгпа 1 Вй! И, МЬо ! Вага Н1, МЬо! Есо й1* Есо й! Тай 1 Ата 1, ХЬо! Нра !! Ата 1, 5а1! Ата 1 П р им еч ание Стрелки указывают точку разрыва: показнив только олив пень ДНК, Рп и Ру — любое пурииовпе и пнримндииовое основания соответственно. Название рестрнктаэы пбрмуют нз первой буквы родового п лвуз первыз букв видового названия Ьродупеит», добавляя к нпм сокращенное наименование системы регтрикаин, если в продупенте их несколько, нлп няименонзпие иезрочосоиного элемента, кодируюнгего данную рестрпктвзу.
Нвяркмер, Есо й1 -- Е. со11 с фактором й! нли Нгпб П1 — Ипгщорзуйпт гя(гпепспе, пгтзнм б рестриктвзв Н!. Химический и энзиматический синтез генов имеет определенные преимущества перед их поисками среди рестрикционных фрагментов. Тем не менее они имеют и недостатки, поскольку синтетические гены чаще всего лишены ряда регуляторных элементов (гл, 17), необходимых для их полноценной экспрессии. 11.5. Клонирование генов. Векторы Для выделения нужного фрагмента ДНК в препаративных количествах его необходимо встроить в плазмилу — вектор, вскрытую той же рестриктазой, которую использовали для получения рестриктов геномной ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
