Ю.А. Золотов - Методы химического анализа (Основы аналитической химии, том 2) (1110130), страница 20
Текст из файла (страница 20)
М фе менты — комплексы, состоящие нз песка лькнх моле л ачногне ч рме валентными связями. белка ( бъедиииц), соединенных между собой нековалентн ми Установлено, что белковая часп фермента (алофермент) может быть связана с небелковыми компонентами (ко„. рам , акяю и); такой комплекс называется холоферментом. том). Иногда выделяют участок, связываюшии участок, содержащий катапитнчески ива битов мпнвные группы белка или кофактоРы (часто эти участки совпадают). и З 1С„~ > Длл многих ферментов, состоящих из субьешпппь характерно наличие так г(феряпп) называемых регулягорных участков, мзторые взаимодействуют с вешест- мипЬ влюпощими на активность фермента, т.
е. его эффеюиорами — акРнс. 9.34. Процессы в активном центре фермента (1) (превращение субакпшностьферментв(рис.9.34). страта) я его регуяяторных участках ФеРменты обладщот Радон (П, и1) (взанмодействне с ивтнбвтором уникальных свойств, которые выде- и активатором) лают их на фоне обычных органических катализаторов гомогенного о тица Прежде всего это необычайно высокая каталмпичесхая актив носщь Так, добавка незначительной концентрации фермента (10 ' — 10 ' М) з ц ускоряет превращение субстрата в 1О -1О раз. Другое не менее вэжл ее своиспю ферментов — избирательность (специфичность) их действ из з отношении структуры субстрата, типа реакции и условий ее проведения Специфичность определяется способностью фермента превращать толь« данный тип субстратов в определенных реакциях и условиях.
Эти свойст. ва ферментов обусловлены сложной структурой макромолекул белка з сложным механизмом их действия. Механизм этот заключается, в част ности, в сорбции субстрата на ферменте и образовании ими активного кои плекса в результате гидрофобных, полярных и ионных взаимодействий; з этом комплексе происходит сближение и ориентация реагирующих груня фермента и субстрата. Взаимодействие между ферментом и сорбировзн.: ным субстратом имеет полифункциональный характер, при котором молекула субстрата подвергается атаке сразу нескольких каталитических групп активного центра фермента, что и обусловливает, в частности, его высокую каталитическую активность.
Важным свойством ферментов, которое необходимо учитывать прл практическом их использовании, является счпабильнасть, т. е. способность сохранять каталитическую активность в течение достаточно длительного времени. При хранении и особенно в ходе ферментативной реакции фермент может частично ици полностью терять свою каталитическую активность (инактивироваться). Одним из эффективных способов стабилизации ферментов является их иммобилизаиия, т.е. перевод в водонерастворимое состояние путем связывания с носителем или модифицнрование водорастворимыми полимерами с полным или частичным сохранением ферментами каталитическоп активности. Разработаны физические и химические способы иммобилизации ферментов.
К физическим способам иммобилизации относятся: адсорбция на нерастворимых носителях; включение в пбры геля или полимера; пространственное отделение фермента от остального объема реакционной системы полупроницаемой перегородкой (мембраной). Химическая иммобилизация осуществляется за счет создания ковалентных связей между белком и носителем с участием «сшивающих» агентов (например, глугарового альдегида).
Повышение стабильности ферментов вследствие иммобилизации значительно облегчает их хранение, транспортировку, применение в экспедиционных условиях, а возможность многократного использования иммобилизованных ферментов значительно снижает стоимость ферментативных методов анализа. 112 ь с аты, активае ментативными методами можно определят стр б ые ингибиторы ферментов. Пределы обнаб тимые и нео ратимые инги торы, о рз зависят не только от каталитическои ако делаемых веществ ззз сги, т их характеристик используемой индикатэвиости ости фермента, но и от других хар торной реакции. акция описывается обычно схемой Простейшая односубстратная реакция — Ментен Мнхзэлнса А Ю2 Е»Я++ЕЕ-ьЕ+Р Ф, — мент; Б — субстрат; ЕЯ вЂ” промежуточный комплекс ферменс субстратом (комплекс Михаэлиса); Р— продукт.
Ри та с с атом описывается уравчэльная стацио парная скорость образования продукта пением А„„[ЕЩ, К +[Я) (9.76) е х =, К =(х,+х,)/»,. Согласноуравнению(9.7б), концентрация субстрата [Е)е будет пропорциональна ч„только при [ %.= — ' й [Е) ледовательно, ихаэлиса (К ). Нижняя ~ренина опре- страта ограничена конппантой )ч(ихаэлиса, „. иж ага о делается величиной че, котораа делаемых концентраций субстрата апре икс ована с помощью используемого для наблюдения нн ументального метода; причем чем выше и стрх ~Б, . Таким образом, использована чо дяя для одного и того же значения ое значение (г ) и повышение ег о ние высокоактивного фермента (большое з а ожет с ественно снизить предел концентрации в реакционной смеси мож ущ обнаружения субстрата.
Н ее колько ути лрутие кинетические закономерности еду сл ет учитывать при опекюрами ютса зфф кюР ми ч „ментов. Обратимые неконкурентные иатибиторы, взаимодействуя с ермеатом, р~зуют катэлэтически неактивные комплексы Е! по реакции Е+!1-[Е1, (9.78) где 1 — ингибитор; К, = [Е1)(([Е) [1)) — константа иигибировэиия, а делаемых концентраций обрати- Можно цоказаь, что верхняя граница опред . Аналогичные ограничения существу- ' мых ингибитороз зависят от величины зато оэ рмеитов. ют и пря определении обратимых активатор р в — ып 113 Р азработано большое число высокочувствнтельных и селе и селектнвных ферментативных методов определения субсгратов и эффекторов фермен тов — неорганических (ионов металлов, анионов) и органических (Хъ 3 Ръ О-содержащих) соединений.
Методы определения эффекторов менее селекгивны, но часто более чувствительны, чем методы определения субсгратов. В табл. л. 9.15 приведены некоторые примеры определения субстратов и ингибиторов ферментов. Т а бл н ц а 9 15 Примеры использования ферментов дпя определения их субстратов (1) и инпгбиторов (О) Ннлнкаторная реакция Определяемое с,М вещество Класс ферментов, фермент Оксндоредуктазы Пероксндаза восстановительная Нгфг (1) 5 1О 10-гг Нъгг ° (11) Зтанол (1) Алкогольоксндаза Алкогольпеплюопяиза ! 1а' 1 10 " Гидролазы Уреаза Щелочная фосфатаза !.1О 2.10 32 3 10 '~ Кислая фосфатяза Холннзстерзза Р-содержащие пестициды 1 и!О *с — нижняя граница опредсляемых концентраций, 22 НАД вЂ” ннкотинамндаденнндннуклеотяд. Ферментатнвные методы широко применяют при анализе разнообразных объектов — медицинских (биологических жидкостей, крови, тканей живых организмов); пищевых продуктов; фармацевтических препаратов; для непрерывного контроля микробиологических и биохимических процессов в производстве.
Зти методы используют дла определения токсичных органических н неорганических соединений объ кру" в екгах окружающей среды — сточных и природных (речных, морских, подземных и др.) водах, почвах, листьях растений и т. д. 114 ОкяслнтельноГомованнлннояая кислота — Н202 о-Днаннзндин — Н О 2 2 Зтанол — НАД Этапа л — НАД Гндролнз Гндролиз мочевн ны Гндролнз и-нлтрофеннлфосфата Гндрслнз н-натрофеннлфосфата Гнлролнз бутнрнлтнохо- линнодида Ая' (И) субстрата Моче анна (1) Рйг+ (11) Нланунакииические методы анализа (ИХА) основаны на снег! фич „м охимические м ун м о соелннения — антиле сост' ыеании определяемого ися в ам с ци,ьнческимн белками кр ителами специ из лл$мн имм алогических про направленных на уда"ение а.ге ун енов — генетически чуже „ых тел).
ИммУнохимиче- ко ~~ий. В иммунохимическом в растворе м элизе п кающии в несколько агади процесс. гггкгга ИСПОльэаяанггс и только первой стадии, которо инципиальн ава 1;1. ется о рати явля ческого анализа основаны на обКласс ические методы имм о н в п ис вни антитела. При этом за проте- вании осадка антителамн в присутствии а разо ванин ем этого процесса сса обычно наблюдают визуально и обнаруживают ° дни е еляют относительно высокие концентр е ации иди полуколнчественно определяют о аитигена. Зги методы длительны н трудоемки.
— титело, а ий комплекса антиген †ан Определение малых концентрац о иниз в аство е, становится возможным, если в д образовавшегося в растворе, с ли антитело) исходных компонентов ре кц ак ионной системы антиген или н высо- ввести метку, которая легко дет ру екти ется соответствующим вые- м инс ментальным методом.
Поскольку комплекс оп еделяемым соединением (антигеном н специ между определ ме ично, экспериментально устатителом образуется строго стехиометрично, хо яшей в состав образующегося иавливаемая концентрация метки, в д а, непос„едственно свазана с конценнммунохимического комплекса, не с трацией антигена. обхо имо эффективное отделе- я п оведения такого анализа не ходимо э иие комплексов от свободных компон либо антитело иммобилизовать на тверлегко решаема, если антиген ли о а . И б лизация позволяет предотвратить агрегацию в дом носителе. Иммо илиза ненты. аство е и азделить иммунн ые комплексы и свободные кампо Р ванна на носителе антнгенов или анти- Возможность прочного связывания н бности к специфическому образованию тел с сохранением их спасо нос п наела к созданию твердофазных иммунохииммунных комплексов привела а ее в мя в химимических методов, ши ок , широко используемых в наставшее время в хи ческом анализе.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
