Получение и применение биологически доступных соединений железа, стабилизированных гуминовыми веществами (1105651), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Для определенияцитотоксичности материалов методом МТТ-теста использовали соль тетразолия (3(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид - МТТ (Sigma))Исследования цитотоксичности проводили с культурой фибробластов линииNCTC clon L-929. Клетки культивировали в среде ДМЕМ/F12 (ПанЭко) (1:1) сдобавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Hy Clone) и 100 Ед/млпенициллин/стрептомицина в атмосфере 5% СO2.Через 24 ч культивирования проводили визуальную оценку состояния клетоки определена их жизнеспособность. Определение жизнеспособности клетокпроводили методом оптической микроскопии путем окрашивания 0,1% растворомтрипанового синего (Sigma). Жизнеспособность клеток определяли как отношениенеокрашенных красителем (живых) клеток к общему числу клеток в поле зрения.Для определения цитотоксичности материалов был применен МТТ-тест,основанный на восстановлении бесцветной соли тетразолия (3-(4,5-диметилтиазол2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид - МТТ (Sigma)) митохондриальными ицитоплазматическими дегидрогеназами живых метаболически активных клеток собразованиемголубыхкристалловформазана,растворимоговдиметилсульфоксиде.Клетки высевали в лунки 48-луночного планшета в концентрации 30 тыс.кл./см2 в среде 500 мкл ДМЕМ/F12 без сыворотки.
В качестве положительногоконтроля использовали клетки в среде ДМЕМ/F12 (1:1) без добавления сыворотки.Среда ДМЕМ/F12 (1:1) с добавлением 20% ДМСО использовалась какотрицательный контроль, так как добавление в культуру клеток 20% ДМСОвызываетихмассовуюгибельиз-завысокойстепенитоксичности55деметилсульфоксида. Через 1 ч часть среды замещали на 250 мкл, 50 мкл и 5 мклсуспензии исследуемых препаратов (концентрация суспензии составила 50, 10 и 1об.%, соответственно) и инкубировали в течение суток. По окончании инкубации вкаждую лунку вносили по 50 мкл раствора МТТ (5 мг/мл в растворе PBS (150 мМнатрий-фосфатный буфер, рН - 7,2, 150 мМ NaCl), профильтрованном черезфильтры с диаметром пор 0,2 мкм). После выдерживания в течение 3 ч при 37ºС вувлажненной атмосфере 5% СО2 жидкость удаляли, вносили по 500 мклдиметилсульфоксида (ДМСО) (Sigma) и, путем встряхивания планшетов прикомнатной температуре в течение 5 мин, растворяли образовавшиеся солиформазана.
Оптическую плотность полученных растворов измеряли на длиневолны 540 нм в лунках 96 луночного планшета с помощью фотометра (BIO-RAD680, США). Число параллельных экспериментов составляло не менее трех.Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Origin,за достоверные принимали различия средних величин по t-критерию Стьюдентапри р < 0,05 2.2.2.2.2 Методикапроведениябиотестированиянарастенияхмягкойпшеницы методом водной культурыПри проведении биотестирования на растениях пшеницы использовалипитательнуюсредуКнопа,которуюготовилиизMgSO4∙7H2O (ч.д.а.),KH2PO4 (ч.д.а.), KCl (ч.д.а.), KNO3 (ч.д.а.), Ca(NO3)2∙4H2O (х.ч.).
Для доведения рНдо требуемых значений использовали 0,1 M NaOH (х.ч.).В качестве положительного контроля использовали коммерческий хелат«Секвестрен» Fe-ЭДДГА. Для приготовления питательных сред применяливысокочистую дистиллированную воду MQ.Растворы исследуемых препаратов готовили на базе питательной средыКнопа, при этом хлорид железа, входящий в состав данной среды, заменяли наисследуемый препарат.
Для приготовления 10 л питательной среды отбиралинавески солей MgSO4∙7H2O, KH2PO4, KCl, KNO3 и Ca(NO3)2∙4H2 O массой 2,9 г; 1,42Автор выражает благодарность с.н.с. лаборатории роста клеток и тканей Иинститутатеоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук (ИТЭБ РАН), к.ф.-м.нДавыдовой Г. А. за проведение экспериментов и помощь в интерпретации результатов.56г; 0,7 г; 1,4 г и 9,8 г, соответственно. Навески солей кальция, калия и магниярастворяли в дистиллированной воде в трёх стаканах отдельно друг от друга,чтобыизбежатьвыпадениянерастворимыхсолей.Содержимоестакановколичественно переносили в пластиковый сосуд емкостью 12 л и доводили объёмдистиллированной водой до 10 л.
При перемешивании 0,1 M NaOH значение pHдоводили до 5,5 (на 10 л питательной среды расходовалось около 1 мл NaOH).Навески железосодержащих препаратов рассчитывали так, чтобы в конечномрастворе концентрация железа составляла 25 мкМ, как в среде Кнопа, где железоприсутствует в виде FeCl3 такой же концентрации. Навески препаратов взвешивалина аналитических весах и растворяли в питательной среде, содержавшей всеостальные компоненты в мерных колбах на 2000 мл.Семена мягкой пшеницы сорта «Крестьянка», взятые с 20%-м избытком,замачивали в чашках Петри по 10 штук в 10 мл дистиллированной воды MQ ипомещали в термостат при температуре 25ºС на трое суток.
Выбирали проросткиприблизительно одинаковой длины и помещали в пластиковые вегетационныесосуды; корни опускали в питательный раствор через отверстия в крышках. Длякаждого варианта использовали по три вегетационных сосуда емкостью 500 мл, вкаждый из которых помещали по 15 растений. Вегетационные сосуды спроростками помещали в климатическую камеру с температурой 25˚С ифотопериодом 12 часов для дальнейшего роста в течение 7 дней.По окончании этого времени, растения извлекали и проводили учет длины ибиомассы.
Сразу же после этого проводили экстракцию хлорофилла ацетоном иопределение содержания хлорофилла в частях растений. Определение содержанияжелеза осуществляли после высушивания растений 3.2.2.2.3 Методика проведениябиотестированиянарастениях огурцахметодом водной культурыДляприготовленияKNO3 (ч.д.а.),3средыХогландаCa(NO3)2∙4H2O (х.ч.),применялиMgSO4∙7H2O (ч.д.а.),следующиесоли:KH2PO4 (ч.д.а.),Автор выражает благодарность сотрудникам кафедры земледелия факультета Почвоведения МГУд.б.н.
Куликовой Н.А., Филипповой О.И., к.б.н. Лебедевой Г.Ф. и к.б.н. Железовой С.В. за помощь впроведении биотестов, обработке и интерпретации результатов.57H3BO3 (х.ч.), MnCl2(ч.д.а.), ZnSO4 (ч.д.а), Na2MoO4 (х.ч.), CuSO4 (х.ч.), 0,5мМCaSO4 для замачивания семян и 0,1 M раствор NaOH (х.ч.) для доведения pH.Для проведения биотестов на растениях огурцов методом водной культурыиспользовали питательную среду Хогланда, которую готовили согласно работе[181] с некоторыми изменениями: железо вносили в виде исследуемых препаратовc концентрацией 25 мкмоль/л, а не в виде цитрата Fe(III) с концентрацией 10мкмоль/л, а тзначение pH раствора составляло 8,5 вместо 6,5. Данная концентрацияжелеза была выбрана потому, что опыты на растениях пшеницы проводили приконцентрации железа в питательных средах 25 мкМ; более высокое значение pHбыло выбрано, чтобы приблизить условия эксперимента к природным, так какжелезодефицитный хлороз проявляется в первую очередь при высоком уровне pH.Семена огурцов сорта «Дальневосточный» замачивали по 10 семян в чашкахПетри в 10 мл дистиллированной воде и помещали на 2 дня в термостат притемпературе 25ºС, после чего переносили в чашки Петри с 10 мл 0,5 мМ CaSO4 ивыдерживали ещё 1 сутки в растворе сульфата кальция при температуре 25ºС.Далее по одному проростку огурцов помещали в вегетационные сосуды ёмкостью130 мл, на каждый тестируемый препарат (вариант) высаживали по 15 растений.Питательные среды готовили непосредственно перед экспериментом,навески солей макроэлементов растворяли в дистиллированной воде MQ,микроэлементы вносили из концентрированного совместного раствора.
Раствормикроэлементов готовили путем растворения навесок микроэлементов в мернойколбе на 1000 мл, переносили в сосуд из темного стекла, хранили в холодильнике ипри приготовлении свежих питательных сред на 5 литров питательной средывносили по 1 мл.По окончании этого периода времени, растения извлекали из вегетационныхсосудов и проводили учет длины и биомассы (см. пункт 2.2.2.5). В тот же деньпроводилиэкстракциюхлорофиллаацетономиопределениесодержанияхлорофилла в частях растений (2.2.2.6). Определение содержания железапроводили после высушивания растений (2.2.1.8).582.2.2.4 Методика проведениябиотестированиянарастениях огурцахметодом почвенной культурыЭксперименты методом почвенной культуры выполняли с использованиемаридных пустынных почв 4 с растениями огурца в качестве тест-культуры.
Субстратбыл составлен усреднением 8 образцов (подробное описание см. в Приложении 2),отобранных в пустыне Нейдж (Оман). Проростки огурца проращивали втермостате в течении трех суток при температуре 25ºС. По 100 г почвенногосубстрата помещали в пластиковые вегетационные сосуды емкостью 130 мл иполивали 10 мл дистиллированной воды. В почвенный субстрат помещалитрехдневные проростки пшеницы и добавляли по 20 мл растворов исследуемыхпрепаратов железа. На каждый вариант брали по 4 растения огурца, которыевыращивали в климатической камере в течение 30 дней, каждые 7 дней поливаярастения 20 мл исследуемых растворов, и каждые 3-4 дня 20 мл дистиллированнойводы.2.2.2.5 Методика определения длины и биомассы растенийДля определения длины проростков пшеницы корни и побеги отделяли позерновке, отдельно с помощью линейки измеряли длину побега до кончика самогодлинного листа и длину корня по самому длинному корню.
Для огурцов длинупобега измеряли по стеблю, длину корней по самому длинному корню.Массу побегов пшеницы определяли, взвешивая одновременно все побегирастений из вегетационного сосуда (15 штук), массу сырых корней измеряли послекратковременного высушивания корней фильтровальной бумагой, в некоторыхслучаях определяли массу сухих корней после высушивания их в сушильномшкафу.2.2.2.6 Методика определения содержания хлорофилла в растительныхобразцахДля определения хлорофилла в растительных образцах использовалиацетон (х.ч.), CaCO3 (ч.д.а.) и кварцевый песок (Merck, 99+).4Автор выражает благодарность заведующему отделом химии и физико-химии почв ПочвенногоинститутаимениВ.В.ДокучаеваРоссельхозакадемиид.с.-х.н.,проф.Ю.Н.
Водяницкомузапредоставленные образцы почв и помощь в обсуждении результатов.59Экстракционноеспектрофотометрическоеопределениесодержанияхлорофилла в растительных образцах [177] проводили в тот же день, когда иопределение биомассы, так как разрушение хлорофилла начинается сразу послеудаления растения с питательной среды. Для оценки накопления хлорофиллапроводилиэкстракциюацетономиспектрофотометрическоеопределениехлорофиллов a и b.Растения мелко нарезали ножницами, отбирали навеску около 300 мг,которую помещали в фарфоровую чашку. В чашку добавляли около 10-20 млацетона, по полному шпателю карбоната кальция и кварцевого песка; полученнуюсмесь тщательно перетирали фарфоровым пестиком до равномерной кашицы,несколько раз добавляя ацетон. Далее полученную смесь фильтровали черезстеклянный фильтр на водоструйном насосе, собирая прозрачный зеленыйацетоновый экстракт; при этом на фильтре оставались бесцветные сухие остатки.Полученный раствор количественно переносили в мерные колбы на 50 или 100 мл.Записывали оптические спектры поглощения полученных экстрактов вдиапазоне длин волн от 200 до 800 нм.
Затем из измеренных значений оптическойплотности при 662 и 644 нм по формулам I и II вычисляли содержание висследуемых растворах хлорофиллов a и b, и содержание пигментов в исходныхрастениях (в мг/г).Ca=9,784∙D662 – 0,990∙D644(I)Cb=21,426∙D644 – 4,65∙D662(II)Для характеристики функционального состояния растений использовалитакие параметры, как содержание каждого из пигментов хлорофилла a и b, а такжеих суммы (a+b) и отношения (a/b).2.2.2.7 Методика определения значения pH водной вытяжки почвОпределение значения pH водной вытяжки образцов почв проводилисогласно [137].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
