Диссертация (1103678), страница 9

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 9)

С повышением полимерной фракции SS гемоглобинаизмеренная жесткость при растяжении увеличивается и составляет 900 мН/м, жесткость при сдвиге – 0.1 мН/м.1.5 Ионный обмен и регуляция объема эритроцитаВ связи со своей основной функцией – транспортом кислорода - эритроцитимеет высокую внутриклеточную концентрацию гемоглобина. В среднем в эритроците человека содержится 30⋅10-12 г гемоглобина, что соответствует его концентрации около 33 г/дл (5 мМ) [99]. Эффективный радиус молекул гемоглобина соoставляет 32 А [100]. Осмотическая активность непроникающих через мембранумолекул в эритроците, составляющая около 20 мM, определяется, в основном, ге-48моглобином и некоторыми небелковыми метаболитами [101−105].

Вне клеткиосмотическая активность непроникающих через мембрану соединений (значительная часть которых приходится на альбумин) существенно меньше иТаблица 1.5 − Стационарные значения внутриклеточных концентраций ионов иобъема эритроцита для нормальных физиологических условийИоныЗначение концентрацииЕдиницы измеренияИсточникиNa+16.6 ± 1.6мМ/л клеточной воды[106,107]K135 ± 5.0мМ/л клеточной воды[106,107,108]Cl- + HCO3-103 – 107мМ/л клеток[109,107]Непроникающиеанионы17мМ/л клеток[109,110]Объем84-100мкм3+[1,111-114]составляет около 5 мМ.

Объем эритроцита определяется балансом значений осмотичности внутри и вне клетки. В организме существует неравновесное асимметричное распределения ионов Na+ и K+ между клеткой и средой (внутриклеточныеконцентрации Na+ и K+ составляют около 20 и 135 мM (таблица 1), а внеклеточные 150 и 5 мM, соответственно [103,105]).

Это неравновесное распределениедостигается за счет работы – Na+-K+ - насоса, обеспечивающего активный транспорт ионов и формирование ионных градиентов.В многочисленных экспериментах показано, что изменение осмотичностисреды приводит к изменению объема эритроцита [115].

При уменьшении объемаэритроцита концентрация белков в клетке возрастает, его вязкость возрастает, иэритроцит теряет возможность проходить через узкие капилляры [116]. Уменьшение объема всего на 20 % снижает скорость фильтрации эритроцитов через узкиекапилляры более, чем вдвое. Увеличение объема на 20 % приведет к тому, чтоэритроцит застрянет в капилляре диаметром 4−5 мкм.

Таким образом, объемэритроцита должен быть точно отрегулирован.Регуляцию объёма эритроцита изучают с 1959 года, когда в работе Тостесона [117] было высказано предположение о том, что ионная асимметрия связанас осморегуляцией. В работе Тостесона и Хоффмана 1960 года [118] была представлена модель клетки, которая контролирует состав катионов и объема с помо-49щью пассивных потоков натрия и калия через мембрану и активных потоков этихже ионов, создаваемых Na,K-АТФазой, работающих параллельно. Однако из-занеточностей измерений не удалось получить правильного соотношения потоковNa+ и K+ для Na,K-АТФазы. Современный вид и дальнейшую разработку модельполучила в работах [111-114]. Основной вклад в регуляцию объема эритроцитовчеловека вносят катионы калия и натрия, а также анионы хлора и HCO3–.

В работе[112] показано, что для оптимальной работы Na+-K+ - насоса система переносчи-ков связывает три иона Na+, которые находятся внутри клетки, и выводит их наружу. С наружной стороны переносчик связывается с двумя ионами K+, находящимися вне клетки, и переносит их в цитоплазму. Энергия обеспечивается расщеплением АТФ. Кинетика изменения внутриклеточных концентраций калия инатрия описана в модели уравнениями, которые учитывают активный транспортэтих катионов Na+,K+-АТФ-азой и пассивный поток через мембрану по градиентуконцентрации:ddtd  + V  [ K ]i  = 2υ Na , K − ATPase + J KV0 dt (1.22)V  [ Na + ] i = − 3υ Na ,K − ATPase + J Na ,V0 (1.23)где V и V0 – текущее и физиологически нормальное значение объема эритроцита,соответственно, V0 = 92 мкм3; υ Na ,K − ATPase – скорость потребления АТФ Na+,K+АТФ-азой; JK и JNa обозначают пассивные потоки калия и натрия через мембрануэритроцита, описанные в приближении Гольдмана [114]:ϕFJ К = P fK +RT K ϕF exp  −1 RT [ ] − [K ] exp  ϕRTF  +ei(1.24)ϕFJ Na = P fNaRT Na ϕF exp −1 RT [+] − [Na ] exp  ϕRTF+ei .(1.25)Здесь PfNa и PfK – проницаемости мембраны эритроцита для ионов натрия и калия,соответственно; ϕ – трансмембранная разность потенциалов; F – число Фарадея,50R – универсальная газовая постоянная, T – абсолютная температура.

Индексы i и eобозначают внутри- и внеклеточные концентрации, соответственно. В уравнения(1.24), (1.25) вошли как активные потоки, создаваемые работой Na,K- насоса, таки пассивные потоки этих ионов через мембрану. Проницаемость для катионовNa,K низкая – таблица 1.6.Таблица 1.6 − Проницаемости мембраны для ионов в нормальных физиологических условияхР 0fH 2 0 , ч-1Р 0fК , ч–1Р 0fNa , ч–1Р 0fCl , ч–19.72⋅105 [119]1.24⋅10-2 [114]1.22⋅10-2 [114]2 [114]0Примечание.

Р fH 2 0 = 1.8 ⋅ 10−2A V0 c–1 [119]; A V0 ≈ 1.5 ⋅ 10 4 см–1, Р′fH 2 0 = 1.8 ⋅ 10 −2 cм⋅с-1.Распределение анионов определяется только пассивными потоками этихионов через мембрану. Известно, что мембрана эритроцитов высоко проницаемадля анионов: по данным [120,121] проницаемость мембраны для анионов на двапорядка превышает значения проницаемостей для одновалентных катионов – таблица 1.6. В основном, это обусловлено большой концентрацией белка полосы III.Этот канал неселективен для двух основных анионов Cl- и НСО3- [122,123]. Поэтому удобно ввести новую переменную, А- − суммарную концентрацию анионов,проникающих через мембрану.

Высокая проницаемость мембраны для анионовпозволяет считать, что концентрации анионов квазистационарны:[ A− ]e ϕF = exp  −−[ A ]i RT (1.26)−где [ A ] есть сумма концентраций проникающих анионов (Cl- и HCO3-).Из этого уравнения следует, что анионы между внутри- и внеклеточным пространством распределены в соответствии с трансмембранным потенциалом. Болееточно разность потенциалов ϕ – на мембране эритроцита вычисляется по формуле[124]:RT  PNa [ Na + ]i + PK [ K + ]i + PCl [Cl − ]e .lnϕ =−F  РNa [ Na + ]e + PK [ K + ]e + PCl [Cl − ]i (1.27)Необходимо также учесть уравнения, описывающие электронейтральность51внутри- и внеклеточного содержимого, а также осмотический баланс между клеткой и окружающим пространством:[K+] i+[Na+] i−[A-] i+ ZWiZ =[K+] e+[Na+] e−[A-] e = 0(1.28)[K+] i+[Na+]i+[A-] i+WiZ=[K+] e+[Na+] e+[A-] e = 2L = 300 mOsM(1.29)В этих уравнениях учтено, что в клетке есть белки, в первую очередь, гемоглобин,и низкомолекулярные интермедиаты метаболизма, которые дают свой вклад как вэлектронейтральность, так и в осмос.

Предположено, что W − суммарная концентрация всех осмотически непроникающих молекул, и Z − средний заряд этих молекул. Анализ показывает, что более точный учет того, что разные непроникающие через мембрану молекулы имеют разный заряд, мало влияет на результат. Пооценкам работы [112−114], Z = − 0.7.Для описания изменения объема эритроцита за счет потока воды можно использовать стандартный феноменологический закон для транспорта воды черезполупроницаемую мембрану [125] согласно уравнению:d V   = J H 2O ,dt  V0 (1.30)где поток воды JH2O пропорционален осмотическому давлению ∆P , равному разности осмотических давлений внутри и снаружи мембраны:J H2 0 =Pf' AV0νH20∆P.RT(1.31)Здесь P'f [cм⋅с-1] – осмотическая проницаемость мембраны для воды, складывающаяся из проницаемостей липидной мембраны и специфических каналов (аквопо0рина) Р fH 2 0 = P'f А/V0 (таблица 1.6), А – площадь мембраны эритроцита, А = 142мкм2, ν H 2 0 = 0.018 л/моль – молярный объем воды.1.6 Расчет проницаемости ионных каналов, образованныхамфотерицином BПри обработке эритроцита антибиотиками, такими как амфотерицин B(AmB), их проницаемость для ионов и воды увеличивается в несколько раз.

Уве-личение проницаемости вызвано встраиванием в мембрану каналов, собранных из52молекул антибиотика AmB. Механизм формирования каналов AmB был изученметодом электрохимической импедансной спектроскопии [126]. Формированиеканалов, проницаемых для ионов, было зафиксировано посредством катионногокомплекса рутения-2 в среде 0.1 М КСl. При небольших концентрациях (1−2 ⋅10–7М) AmB адсорбируется на мембране в виде мономеров без создания пор и ужепри концентрации 1⋅10–6 М адсорбируется с образованием комплексов, образующих поры. При концентрации AmB 5⋅10–6 М проводимость начинает резко возрастать, достигая максимума при 5⋅10-5 М, далее сохраняя постоянство этого значения. АmB-канал образован двумя полупорами, каждая из которых состоит извосьми молекул антибиотика и стерина [127].

АmB образует стандартные, недеформируемые каналы. Поры, образованные антибиотиками, имеют катионанионную избирательность. Oбнаружено [128], что AmB-каналы обладают слабой, преимущественно анионной проницаемостью. Это объясняется тем, что OHгруппы молекул AmB создают положительный потенциал на стенках поры, способствующий преимущественной гидратации анионов.Добавление AmB в мембрану, содержащую стерол, повышает ее проводимость более чем в 107 раз [125]: от 10–8 до 10–1 Ом–1см–2 для немодифицированнойи модифицированной мембраны, соответственно. Для определения радиуса AmBпор используют свойство непроникающих молекул сахара или гидратированныхионов предотвращать осмотический лизис эритроцитов.

В работе [129] измеренрадиус AmB-пор, который составил 0.4 нм. В работе [130] проведено экспериментальное уточнение радиуса AmB-пор путем использования гидратированных ионов с широким спектром радиусов. Значение радиуса пор составило 0.36–0.37 нм.Проницаемость AmB-каналов запишем в виде:PfAmB = N AmB p AmBf1 ,где N AmB =(1.32)A AmBN уд – количество каналов в расчете на объем одного эритроцита;V0p AmB– коэффициент осмотической проницаемости для воды одиночного AmB каf153нала, A/V0 ≈ 104 см–1 – отношение площади поверхности эритроцита А к его объему V0, N удAmB – удельное количество каналов на единицу площадиN удAmB = g i уд / g k ,(1.33)где gk – проводимость одного канала AmB. Согласно работе [129] gk = 2.5⋅10–13Ом–1.

Например, исходя из значения giуд в таблице 1.7, можно определить удельное количество каналов для соответствующего значения концентрации AmB СА =1.5⋅10–5: N уд =g i удgk= 0.4 ⋅ 1011см–2. Зависимости проводимостей бимолекулярноймембраны от концентрации АmB даны в работе [131]. Коэффициент осмотической проницаемости для воды одиночного АmВ-канала p AmBf 1 можно определитьрасчетным путем, используя формулы, описывающие поток молекул через узкуюпору [132,133].Таблица 1.7 − Характеристики мембраны, модифицированной АmВ (с большим количествомканалов) в растворе 0.1 М NaClПроницаемость для воды,ПроводимостьКонцентрация АmВPf′ , cм⋅сg i уд , Ом смС А, М18⋅10–4 [125]10–2 [125]1.5⋅10–5 [129]–1–1–2Коэффициент осмотической проницаемости p AmBопределяется из соотноf1шения, учитывающего ламинарный поток и процесс диффузии:p AmBf1p dAmB1=RTr2 +1,8ηDV H 2 0(1.34)где r – радиус поры (r = 0.37 нм для AmB-каналов); D – коэффициент диффузии(для воды D = 2.4⋅10–5 cм2⋅с–1); η – вязкость воды (0.89 мПа⋅с); VH 2O – молярныйобъем воды (18 см3/моль).

Характеристики

Список файлов диссертации