Конформационная динамика нуклеиновых кислот при взаимодействии с лигандами (1098269), страница 38
Текст из файла (страница 38)
Слева: определение угловзакрутки квадруплекса. Кругами показаны атомы C1`. Справа: схемавзаимного расположения двух четырёхгранников: внешнего, образованногоатомами N9, и внутреннего, образованного атомами O6. Если планарностьквартета нарушается, то внутренний четырёхгранник выходит из плоскостиквартета. Расстояние между центрами масс внутреннего и внешнего квартетовслужит численным параметром отклонения от плоскости.Для каждой из восьми полученных групп значения параметров объединялись и строилась гистограмма распределения. Для углов закрутки выбран диапазон от 0 до 600; отклонения от плоскости анализировались в диапазоне от 0до 2Å; диапазоны углов и расстояний разбивались на 15 интервалов.
Данныеанализировали с помощью программы Gnuplot.4.1.4Методы моделирования молекулярной динамики систем с аптамером 15-ТВАДля всех систем моделирование и анализ траекторий молекулярной динамики проводилось в программном пакете GROMACS 4.0 [403]. В этой частиработы мы использовали два силовых поля. AMBER-99 , которое известно как250parm99, которое было модифицировано для уточнения параметров угла некоторых аминокислот Сориным и коллегами[404] и адаптировано для примененияв программном пакете GROMACS[405].
Второе использованное нами силовоеполе это parmbc0, которое было адаптированное нами для GROMACS, в основе которого лежит модификация parm99sb[406]. Суть наших модификаций сводиться к оптимизации описания торсионных углов сахарно-фосфатного остова. Всё вычислительные эксперименты проводились в явно заданном растворителе.
Для поддержания температуры соответствующей 300К использовалсяалгоритм ``V-rescale'' [407], который основан на алгоритме скалирования скоростей Берендсена с дополнительным стохаистическим членом, который позволяет точно воспроизводить канонический ансамбль. Для сохранения канонического ансамбля биополимеры и вода с ионами термостатировались отдельно.Это связано с тем, что вода и ионы не имеют вибрационных степеней свободы, а только поступательное и вращательное движение. Для моделирования вNPT ансамбле использовался баростат Берендсена [408], применяемый каждые5 пс. Для описания удалённых электростатических взаимодействий использовалось модифицированное суммирование Эвальда, где вычислялось взаимодействие частица-решётка, а не частица-частица [409].
Исследуемые молекулы икомплексы помещали в триклинную ячейку с отступом 15 ангстрем от крайнего атома, которую наполняли молекулами воды, которые описывались четырёхточечной моделью TIP4P [410]. Избыток отрицательного заряда в системе нейтрализовали заменяя случайные молекулы воды на катионы натрия. Также вовсех расчётах использовали ионную силу свойственную крови, т.е. 0.14 NaCl.Для достижения этого значения необходимое количество молекул воды, также,заменялось на катионы натрия и анионы хлора, при это расстояние между ионами не должно было превышать 6Å. В качестве интегратора, алгоритма который251предсказывает позиции атомов на основе действующих сил, использовался алгоритм leap-frog с шагом 3 фемтосекунды. Каждые 6 пикосекунд конфигурациясистемы сохранялась в файл.Необходимо отметить, что большинство G-квадруплекс содержащих молекул стабилизируются катионом калия.
В нашем исследовании есть системы гдекалий не располагался специально, в остальных случая катион калия помещалив геометрический центр фигуры, образованной атомами О6 гуаниновых оснований остатков квадруплекса. Мы использовали стандартные параметры дляполя parm99 описание катиона калия, радиус Ленарда-Джонса 2.658Å и глубина потенциальной ямы 0.00137 кДж/моль. Катион натрия описывался радиусомравным 1.868Å и глубина потенциальной ямы функции составляла 0.01589 кДж/моль.Все расчёты были проведены на суперкомпьютере ``Чебышев'', доступ накоторый был предоставлен вычислительным центром МГУ.
Для достиженияоптимальной производительности нами была оценена производительность расчёта системы с аптамером (примерно 23000 атомов) в зависимости от количества используемых вычислительных узлов.Анализ файлов траекторий проводился с помощью программ представленных в пакете GROMACS или собственно разработанных. При анализе молекулярной динамики водородная связь считалась существующей если её можно было обнаружить в половине кадров траектории и геометрия положения еёучастников удовлетворяла условию: расстояние между донором и акцепторомне более 3.5Å и угол акцептор-донор-водород не должен превышать 30 градусов.Все расчётные эксперименты и описания систем приведены в Tаблице 4.1252объектaСиловое полеparmbsc0parmbsc0parm99parmbsc0parm99parmbsc0parmbsc0parmbsc0Длина траектории,нс70010900900900900900900ДНКколичество атомовБелокВода Na+G-стебель2600G-стебель без ионов2600РСА 15-TBA4880РСА 15-TBA4880ЯМР 15-TBA4880ЯМР 15-TBA4880ЯМР 15-TBA с Na+ в центре4880ЯМР 15-TBA без катиона в4880центреКонформации с модифицированной TGT петлёйTG(+T) РСА 15-TBAparmbsc09004880TG(-T) ЯМР 15-TBAparmbsc09004880TG(-T) ЯМРр 15-TBAбparmbsc09004880T(-GT) ЯМРр 15-TBAбparmbsc09004880Комплексы аптамер-тромбинРСА аптамер-тромбин комплексparmbsc0 +6004884657parm99SBЯМР аптамер-тромбин комплекс parmbsc0 +6004884658parm99SB1:2 РСА аптамер-тромбинparmbsc0 +6004889314комплексparm99SB1:2 ЯМР аптамер-тромбинparmbsc0 +6004889316комплексparm99SBK+Cl-125161251622516192402252422532225322252834131313131414101111000000000018688183121896820532131313131111000010496449145105104481451554047117815573271178Таблица 4.1: Параметры моделирования молекулярной динамикиОдин катион калия помещён в центральную полость квадруплекса, если неуказано обратное.
б ЯМРр Как стартовая структура использоваласьконфигурация полученная после моделирования молекулярной динамикиЯМР структуры. Последние 100 нс из 900 нс траектории были использованычто бы построить среднею структуру, которая и являлась объектомманипуляций для получения конформаций TG(-T) или T(-GT).a253·10421.8Шагов в минуту, 1/сек1.61.41.210.80.60.405101520253035404550Количество вычислительных ядер, шт.Рисунок 4.2: Эффективность масштабирования вычислений для выбраннойаппаратно-программной платформы Gromacs-``Чебышев'' для системысодержащей 23000 частиц. Описание конфигурации суперкомпьютера можнонайти по адресу http://www.top500.org/system/9240.4.1.5Гибридное молекулярно механическое / квантовомеханическое моделированиеСтартовые конформации для 15-ТВА брали из PDB, ID 1c35 для комплексов с К+ и 1rde для комплекса с Ва2+ .
Было сконструировано 5 систем. Верхнюю позицию катиона (системы 1, 4) определяли как среднее арифметическоеот координат К+ , располагающихся над верхним G-квартетом (остатки G1, G6,G10, G15) в структуре 1с35. Центральную позицию (система 2) определяликак среднее арифметическое от координат атомов О6 гуанинов квадруплекса.Нижнюю позицию катиона (системы 3, 4) определяли как среднее арифмети-254ческое от координат К+ , располагающихся под нижним G-квартетом (остатки G2, G5, G11, G14) в структуре 1с35.
Системы 1-4 были смоделированыс катионами калия, система 2 была также смоделирована с катионом бария.Молекулярно-механическую часть описывали с помощью параметров силового поля parmbsc0. Квантово-механическая часть системы была описана в терминах теории функционала плотности с использованием псевдопотенциалов ибазиса плоских волн (PW-DFT), с применением спин-поляризованного формализма и функционала PW91. Взаимодействия между валентными электронами и ионным остовом описывали сверхмягкими псевдопотенциалами Вандербильта.
Квантово-механическая часть состояла из азотистых оснований 15-ТВА(за исключением Т7, не принимающего участия во взаимодействиях с катионом) и катионов калия или бария. Разбиение систем на квантово-механическуюи молекулярно-механическую части осуществляли по N-гликозидной связис введением атомов водорода для насыщения разорванных связей. В конечном итоге квантово-механическая система состояла из 178 атомов (179 в случае системы 4).
Взаимодействия Ван-дер-Ваальса, плохо описываемые теорией функционала плотности, корректировали аналитическим потенциаломГримми (161). Каждая из моделируемых систем была наполнена водой модели tip4p, заряд компенсировали добавлением ионов натрия. Вода и ионы натрия были уравновешены вокруг комплекса ДНК:К+ (Ва2+) проведением МДв течение 100 пикосекунд с закреплением позиций комплекса.
Подготовленные системы были подвержены комбинированному квантово-механическомуи молекулярно-механическому моделированию (КM/MM) с помощью пакетапрограмм GROMACS/CPMD с траекторией длиной 1,5 пикосекунд, с шагом0,12 фемтосекунды ( 5 а.е.) и электронной массой 500 под контролем термостата Ноза-Хувера при температуре 310К. Базис плоских волн, описывающий255поведение валентных электронов, был ограничен пределом 30 Ry. Использовали кубическую квантово-механическую подъячейку с длиной стороны 40 Ry,что составляло в итоге примерно 90000 плоских волн на волновую функцию.4.1.6Изотремическая калориметрияТермодинамические параметры связывания катионов калия и бария с олигонуклеотидами d(GGTTGGTGTGGTTGG) и d(GGTTGGTCTGGTTGG) оценивали с помощью прибора iTC200, как описано ранее [411].
Эксперименты проводили при температуре 25∘ С в буфере, содержщем 20 мМ Tris, pH 6.8, в присутствии 140 мМ LiCl. Двухмикролитровые аликвоты растворов KCl или BaCl2вносили в ячейку объёмом 0.2 мл, содержащую раствор олигонуклеотидов додостижения концентрации насыщения. Концентрация ДНК составляла 50–250мкМ, концентрация катионов в инжекторе от 1 до 10 мМ. При введении соли вячейку измеряли выделяемую теплоту и полученные значения вычитали из значений, полученных для реакции комплексообразования, получая величину эффективной теплоты реакции связывания.
Полученные кривые аппроксимировали с помощью процедуры нелинейного регрессивного анализа и расчитываликонстанту связывания и стехиометрию реакции. Соответствующее изменениеэнтропии определяли из классических уравнений термодинамики. Все измерения для каждого олигонуклеотида повторяли не менее трёх раз и рассчитывалисреднее значение.2564.1.7Исследование структуры аптамера 31-TGT методамиЯМРАптамеры были получены твердофазным амидитным синтезом и очищеныООО ``ЕвроГен''. Все ЯМР спектры были измерены на спектрометре BrukerAVANCE 600 MHz. ЯМР спектры регистрировались в 20 мM KCl и 10 мM фосфатного буфера и при pH 6.
Концентрация ДНК аптамера в каждой пробе составляла 2 мМ, объем пробы 0,35 мл. Температура образца с аптамером приNOESY D2O, HSQC и COSY экспериментах составляла 25∘ С. При NOESY H2 Oэксперименте температура образца с аптамером составляла 10∘ С. Перед снятием спектров проводился отжиг ДНК. Температура раствора с аптамером былаподнята до 70∘ С с последующим постепенным охлаждением до 4∘ С. Вся работапо расшифровке спектров производится в специальном программном обеспечении по отнесению и интеграции спектров Sparky [412]. Данные о химическихсдвигах необходимые для отнесения спектров были получены с сайта BiologicalMagnetic Resonance Data Bank [413].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
