Конформационная динамика нуклеиновых кислот при взаимодействии с лигандами (1098269), страница 33
Текст из файла (страница 33)
Методами МД нами было изучено изменение структуры аптамера 15-ТВА в зависимости от способа и условий конъюгации с углероднойнанотрубкой.При конъюгации аптамера с нанотрубкой рассматривали несколько линкеров, которые доступны как имидиты для встраивания в цепь ДНК (Рисунок 3.51).Рисунок 3.51: Аминолинкеры и спейсер для модификации 15-TBA.Модифицированные аптамеры содержали аминолинкеры на одном из концов молекулы либо на нуклеотиде Т7, а также спейсер который соединялся саминогруппой (Рисунок 3.51). Такая ``посадка'' линкеров позволяет охватить213наиболее общие варианты связывания 15-TBA с нанотрубкой: через 3'-конец,5'-конец или внутренний нуклеотид.
Исследование спейсеров разной длины нацелено на то, чтобы подобрать оптимально подходящее для функционированиярасстояние между нанотрубкой и аптамером.Наряду с ковалентным присоединением аптамера к нанотрубке мы рассматривали вариант нековалентной сорбции коньюгатов аптамеров с полисорбатом(Tween-20). Сорбция происходила благодаря гидрофобному эффекту между полисорбатной частью конъюгата и нанотрубкой. В выбранном силовом поле несодержится описания для спейсера, линкеров и Tween-20. С помощью программ R.E.D. и Gamess US [379; 380] были рассчитаны частичные заряды наатомах для соответствующих конъюгатов.
Так как точно неизвестно, насколько плотно могут молекулы Tween-20 покрывать нанотрубки и как это можнорегулировать, то в расчётной части были реализованы два крайних случая. Впервом – на каждую молекулу аптамера приходится одна молекула Tween-20.Во втором варианте молекул Tween-20 столько, что они покрывают нанотрубкимонослоем (30 штук).Итак, было исследовано 30 систем, которые различаются:• модификацией аптамера (5 групп)– 5'-аминолинкер– 5'-аминолинкер + спейсер– 3'-аминолинкер– 3'-аминолинкер + спейсер– dT-аминолинкер• ионами (2 группы)214– противоион тетраметиламмоний– противоион натрий + физиологическая концентрация NaCl;• способом присоединения к нанотрубке, или функционализацией (3 группы)– ковалентная– гидрофобное взаимодействие (через Tween-20 с высокой концентрацией чистого Tween 20)– гидрофобное взаимодействие (через Tween 20 с низкой концентрацией чистого Tween 20)Использование тетраметиламония вызвано необходимостью иметь внутренний контроль для систем, где катион не проникает в центральную полостьквадруплекса.Модифицированные таким образом системы исследовали методом МД.Время наблюдения каждой системы в моделировании МД составило 1 мкс.
Выявлено, что конформация аптамера в каждой системе по-своему уникальна. Так,в одних системах сохранялся G-квадруплекс, в других его не было, а в большинстве систем нельзя невозможно было сделать однозначные выводы.Так как простого способа оценки стабильности квадруплекса пока нет, дляформального анализа конформации мы использовали несколько критериев.Во-первых, G-квадруплекс 15-TBA состоит из двух квартетов, наличие которых является необходимым и достаточным условием существования квадруплексной конформации.
Мы можем исследовать каждый квартет отдельно.Число водородных связей между азотистыми основаниями квартета колеблет-215ся от 0 до 8. С помощью этого критерия можно косвенно оценивать расстояниемежду азотистыми основаниями.Во-вторых, характерная структурная особенность квартета заключается втом, что он плоский, то есть все атомы азотистых оснований лежат в однойплоскости. Оценить, насколько любая конкретная конформация гуанинов квартета отличается от планарной, можно с помощью системы расчетов.В-третьих, Следующий критерий также происходит из оценки планарностиплоскости квартета. Для его расчёта необходимо построить 2 плоскости: черезатомы O6 гуанинов и через атомы C1' дезоксирибоз. Двугранный угол между полученными плоскостями и будет необходимой величиной планарности.В плоском квартете квадруплекса этот угол будет равен 0 градусов.
Угол будетпринимать минимальные значения, если азотистые основание симметрично выгнуты. Таким образом, в случае отклонения квартета от плоской конфигурацииэтот критерий покажет, насколько азотистые основания выходят из плоскости.В-четвертых, мы оценивали взаимодействие аптамера с нанотрубкой.Известно, что поверхность нанотрубки может быть вовлечена в стэкингвзаимодействия с ароматическими группами, что в случае с одноцепочечными НК приводит к их наматыванию вокруг нанотрубки. По этой причине насинтересовало, взаимодействует ли аптамер с нанотрубкой и в какова поверхность контакта. Измерить это можно, посчитав расстояние от центра масс квартетов до продольной оси нанотрубки. Радиус нанотрубки составляет 11 Å.
Еслиодин квартет аптамера в G-квадруплексной конформации вступает в стэкингвзаимодействие с нанотрубкой, то рассчитанное расстояние будет больше радиуса нанотрубки примерно на два ван-дер-ваальсовых радиуса. При этом второйквартет будет находиться от поверхности нанотрубки на расстоянии примернов два раза большем, чем первый. В случае же наматывания аптамера на нано216трубку расстояние от центра масс атомов квартета может уменьшиться вплотьдо 0 Å.Для каждой системы проведён анализ всех вышеописанных параметров.Трёхмерные графики содержат точки для каждого момента траектории с шагом в 200 пс в пространстве описанных критериев. Для возможности оценкиэволюции системы во времени каждая точка окрашена цветом в соответствии сприведённой шкалой – от чёрного до жёлтого.
На двумерном графике показанорасстояние от центра квартетов до оси нанотрубки и радиус нанотрубки.Рассмотрим детально примеры стабильной и нестабильной структур. Стабильным оказался аптамер с 5'-аминолинкером и спейсером, в соли NaCl, сгидрофобной функционализацией при высокой концентрации Tween-20 (Рисунок 3.52).Рисунок 3.52: Пример системы аптамер-нанотрубка со стабильнымG-квадруплексом: аптамер с 5'-аминолинкером, гидрофобнаяфункционализация через Tween 20 при высокой концентрации Tween-20 вячейке с раствором NaCl.217Распределение точек для обоих квартетов очень похоже (Рисунок 3.53).
Высокая плотность точек в определённой области указывает на стабильную конформацию. Независимо от времени, значения планарности и двугранного углаблизки к нулю, а количество водородных связей лежит в основном в пределахмежду 6 и 10, что говорит в пользу того, что это G-квадруплексная конформация. Хотя мы считали, что число водородных связей в аптамере не превышает 8,здесь обнаружены структуры с 9-ю и 10-ю водородными связями – и, действительно, по формальным критериям водород при атоме N1 может участвовать вдвух водородных связях одновременно.
Также можно заметить, что в течениевсего времени моделирования МД квартеты находятся на значительном расстоянии от нанотрубки – не менее 15 Å от её поверхности. Такого расстояния недостаточно для прямого контакта. Очевидно, этому препятствует ``шуба'', образованая из молекул Tween-20. Однако со времение квартеты постепенно приближаются к нанотрубке. Возможно, при более длительном наблюдении аптамердостигнет поверхности трубки.Рисунок 3.53: Пример графиков оценки конформации для системыаптамер-нанотрубка со стабильным G-квадруплексом: аптамер с5'-аминолинкером, гидрофобная функционализация через Tween-20 привысокой концентрации Tween-20 в ячейке с раствором NaCl.218Теперь обратимся к системе, в которой аптамер потерял исходную конформацию и накрутился на нанотрубку.
Это система с 3'-аминолинкером и спейсером на аптамере, с тетраметиламмонием в качестве противоиона, гидрофобнойфункционализацией без чистого Tween 20 (Рисунок 3.54).Рисунок 3.54: Пример системы аптамер-нанотрубка с обернутым вокругнанотрубки аптамером: аптамер с 3'-аминолинкером и спейсером,гидрофобная функционализация через Tween 20 при отсутствии Tween-20 вячейке с противоионом TMA.Распределение точек квартетов совершенно различны (Рисунок 3.55). Длявторого квартета заметно скопление точек в области квадруплексной конформации в начальный момент времени (не более 100 нс), а после область точекстановится более размытой.
В ходе моделирования оба квартета не имеют квадруплексной конформации: водородных связей немного, а планарность и двугранный угол, наоборот, принимают высокие значения. На третьем графике показано, что центры масс квартетов лежат от оси трубки на расстоянии меньшем,чем её радиус, то есть аптамер намотан на нанотрубку.219Рисунок 3.55: Пример графиков оценки конформации для системыаптамер-нанотрубка с намотанным на нанотрубку аптамером: аптамер с3'-аминолинкером и спейсером, гидрофобной функционализацией черезTween 20 в отсутствии чистого Tween-20 в ячейке с противоионом TMA.Сравнение стабильности 15-ТВА-содержащих системНа основании анализа все системы были поделены на пять групп: с однимстабильным квартетом (4), с двумя стабильными квартетами (44), с полностью развёрнутыми квартетами (8), с развёрнутыми квартетами и обёрнутойвокруг нанотрубки ДНК (8l), а также группа с частично развёрнутыми квартетами (Ö) (Таблица 3.9).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
