Конформационная динамика нуклеиновых кислот при взаимодействии с лигандами (1098269), страница 31
Текст из файла (страница 31)
По той же причине основание остаткаG8 смщается в сторону остатка Т9 и TGT петля закрывает верхний выход изквадруплекса (Рисунки 3.33, 3.32, 3.40).Очевидно, что петли не являются принципиально важными элементами длясвязывания катиона с G-ДНК. Однако они значительно модулируют весь процесс.
Моделирование показывает TGT петля играет три независимые роли. Первое, она защищает структуру 15-ТВА от разрушения структуры в отсутствиикатиона, как мы наблюдали 40% вероятность того, что структура квадруплексабудет потеряна в ожидании захвата катиона, если удалить TGT петлю. В тоже время TGT петля замедляет первоначальное связывание катиона заслоняявход в центральный сайт квадруплекса. Мы наблюдали как конструкция безэтой петли захватывает катион быстрее, но и одновременно более подверженаструктурной деградации. Как только катион оказывается внутри квадруплекса,петля помогает сохранить катион во внутренней полости, благодаря смещениюоснования G8. Суммируя выше сказанное можно заключить, что TGT петля оказывает стабилизирующую роль с структуре 15-ТВА.Корреляция движений катионов во время полного обмена ионами междуG-ДНК и растворомМы впервые в моделировании обнаружили случайный обмен катиона связанного с квадруплексом G-ДНК с катионом из раствора (Рисунок 3.42).
Этослучилось в одной из тех систем, где у аптамера 15-ТВА были удалены ТТ петли. Выталкивание катиона происходит через нижнюю часть молекулы. Процессвыдавливания катиона начинается с приближения другого катиона с противоположной выходу стороны, т.е. со стороны TGT петли (верхний связывающий200сайт). Катион из раствора (промежуточное связанный в верхнем сайте) занимает центральный сайт связывания как только его покидает предыдущий катион.Благодаря этой корреляции между промежуточным связыванием и высвобождением катиона из центральной полости квадруплекса, центральный сайт неостаётся пустым. Это показывает, что вероятно для большинства G-ДНК катионный обмен происходит без потери стабильности всей структуры, по крайней мере это справедливо для двух квартетных квадруплексов.
Факт корреляциямежду связыванием катиона из раствора и выталкиванием катиона из центральной полости может сильно стабилизировать как малые квадруплексы, так и промежуточные состояния при самосборке G-ДНК. Когда предполагается участиекатиона из раствора в обмене, молекула с N последовательными квартетами может выпустить любой катион в центральной полости квадруплекса через промежуточные состояния c N-1 связанными катионами (Рисунки 3.42, 3.47).Рисунок 3.47: Обмен катионами в молекуле построенной из Nпоследовательных квартетов.
Приходящий катион отмечен чёрным, асвязанные с квадркплексом, белым.201Этот эффект вероятно менее важен для протяжённых квадруплексов, состоящих, например, из четырёх квартетов. Такой квадруплекс чрезвычайно стабилен связывая всего два катиона во внутреннюю полость. Он легко может обменять катион с раствором через последовательность переходных состояний имеядва катиона внутри полости, разделяя события связывания катиона из раствораи выход катиона в раствор [117; 363].Предварительные МД/КМ экспериментыПредварительное распознавание катионов верхним и нижним сзывающимисайтам может быть описано в терминах электростатического взаимодействия.Однако, взаимодействия катиона с ДНК более сложны и только приблизительно описываются классическими силовыми полями используемыми в моделировании МД [347].Таким образом, координационная составляющая взаимодействия катиона с аптамером не рассматривается.
К сожалению полное квантовохимическое (КМ) описание такой небольшой молекулы как 15-ТВА, всё ещё запределами современных вычислительных возможностей. Гибридные КМ/ММмоделирования стали распространёнными подходами в исследовании взаимодействий биополимеров с катионами, так как предложили разумный компромисс между скоростью и точностью расчётов [53; 347; 372]. Даже такие подходы весьма требовательны к вычислительной мощности, и современные работысообщают о времени наблюдения в пикосекундной шкале.
Этого к сожалениюне достаточно для достижения равновесия системы. Однако, несколько пикосекунд предоставить грубое представление об происходящих процессах в системе.Используя метод МД/КМ мы исследовали стабильность положения катионакалия во всех трёх сайтах связывания. Расчёты подтвердили результаты класси202ческого моделирования указали на низкую вероятность стехиометрии 1:2 комплекса аптамера 15-ТВА с катионами калия. Один из катионов в комплексе 1:2сместился в сторону раствора, но не покинул зону аптамера. Тем не менее мысчитаем, что стехиометрия комплекса 1:1 и катион калия расположен в центреквадруплекса, между квартетами.
В таком положении катион в среднем координируется атомами кислорода О6 из оснований гуанина благодаря электростатическим и донор-акцепторным взаимодействиям. Для внутреннего контрольного эксперимента, мы выбрали катиона бария. Катион бария имеет близкий кстронцию размер и заряд, что приводит к практически идентичным спектрамкругового дихроизма комплексов аптамера 15-ТВА с катионами бария и стронция [373]. Стехиометрия комплекса между стронцием и аптамером 1:1 и весьмавероятно, что катион находится во внутренней полости между квартетами. Расчёты были проведены с катионом бария исключительно из практических аспектов работы со стронцием, стронций склонен к накапливанию в тканях, а барийне имеет такой особенности.
В экспериментах по калориметрии мы использовали барий и поэтому в расчётах был использован тоже барий.В МД/КМ расчётах мы показали, что находясь в центральном сайте связывания положение катиона бария очень стабильно. Катион координируют всевосемь атомов кислорода О6 из гуаниновых оснований остатков квадруплекса.В итоге не смотря на на все ограничения накладываемые в МД/КМ моделировании, эти расчёты показывают, что особенности электронной структуры неменяют основного заключения из классического моделирования о том, что существует стабильный комплекс аптамера с двумя катионами калия.203Калориметрические измеренияНаши эксперименты по титрованию комплекса методом изотермической калориметрии указывают, что стехиометрия комплекса аптамера 15-ТВА как с катионом бария так и калия близка к соотношению 1:1. Более того, исследованиеконкуренции показало, что катионы занимают один и тот же связывающий сайт.Эти результаты полностью подтверждают наши расчёты.Вариативность пути связывания участвует в динамике и образованииструктуры квадруплексных ДНККроме механистического представления о путях попадания катиона в внутреннюю полость квадруплекса, наши результаты проливают свет на вопрос оттом, что первично, образование структуры квадруплекса и захват катиона израствора или сборка структуры вокруг катиона.
Правильно собранная структура аптамера 15-ТВА без катиона способна сохранять свою структуру в течении сотен наносекунд, что очевидно, достаточно для того, что бы встретитьв растворе катион захватить его в растворе с ионной силой порядка ≈0.1-0.2М. Экспериментально было показано, что 15-ТВА может организовать мономолекулярный G-квадруплекс растворе при низких температурах при отсутствиивозможности быть стабилизированным катионом [374]. Вероятно, что при комнатной температуре существует динамическое равновесие между собранной ирасплавленной структурами, появление катионов подходящего радиуса смещает равновесие в сторону собранной структуры.
Таким образом, катион не является инициатором сборки, а стабилизирует собранную и частично собранныеструктуры. Хотя такой процесс за пределами нашего времени наблюдения засистемой, мы также полагаем, что сам процесс сборки происходит через набор204разнообразных и вероятно независимых путей. Это также в согласуется с более ранними и исследованиями по моделированию вероятных промежуточныхсостояний при формировании параллельного квадруплекса из четырёх тяжейd(G4 )4 [375]. Разные микросостояния (и вероятности их существования) могутпо разному реагировать на изменение как последовательности петель так и изменение внешних условий.Сложность структурных перестроек в квадруплексных ДНК может бытьпроиллюстрирована захватом катиона аптмером 15-ТВА показного в этой работе. Захват катиона молекулой аптамера это достаточно простое событие вструктурной динамики квадруплексных ДНК включая процесс их самоорганизации.
Уже собранные квадруплексные ДНК могут обмениваться катионами сраствором. В наших исследованиях включая как нативную структуру аптмератак и её модификации, у которых были удалены некоторые петли, мы обнаружили 23 события проникновения катиона в центральный сайт связывания израствора. Моделирование МД ясно показывает, что кинетика между двумя состояниями, собранной 15-ТВА с катионом и аптамера без катиона, достаточносложна.
Мы наблюдали разнообразные пути проникновения катиона во внутрьквадруплекса со значительной разницей между катионами калия и натрия (Рисунки 3.33, 3.34, 3.38, 3.40). События, типа которых мы наблюдали, могу игратьважную роль в процессах структурной самоорганизации, обмен катионами ивзаимодействия с другими молекулами. Наши расчёты показывают, что дажетакой простой процесс как захват катиона это достаточно сложный и вариативный процесс. Выбор между разными путями может строго зависеть от типа катиона. Мы полагаем, что в целом, все процессы связанные с самоорганизациейквдруплексных ДНК сложны и обладают вариативной природой индивидуальной для каждой последовательности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
