Конформационная динамика нуклеиновых кислот при взаимодействии с лигандами (1098269), страница 28
Текст из файла (страница 28)
Последующее восстановление структуры аптамерапроисходит достаточно медленно из-за нового взаимодействия G1-T9, котороесформировалось одновременно с первичным захватом катиона. К 156-й нс наблюдения полного восстановления структуры не произошло: изменена конформация остатка G1 из-за вращения вокруг связи C3'-O3' и значение торсионногоугла c 174∘ до 68∘ (Рисунок 3.39).Квадруплекс полностью не восстановил структуру до конца времени наблюдения. Хотя траектория длиной 300 нс считается продолжительной – при срав-176Рисунок 3.38: Проникновение катиона калия в структурнодестабилизированный квадруплекс.Рисунок 3.39: Изображение вращения остатка G1 вокруг торсионного угла .нении с используемыми в большинстве аналогичных исследований, – этого времени недостаточно для покрытия всех конформационных переходов в молекулах такого размера.
Поведение систем с КСl в растворе с 15-ТВА в целом согласовывалось с наблюдениями. описанными выше. В обеих системах наблюдалиизменения структуры 15-ТВА при связывании катиона калия. В первом случае,как в системе, обсужденной ранее, остаток G1 изменял конформацию, вращаясь вокруг связи C3'-O3', и торсионный угол изменил значение c 174∘ до 74∘ .Это привело к увеличению площади поры между гуанинами верхнего квартета. Вторые ворота были открыты, в то время как первые (конформация TGTпетли) закрывались, как только катион попадал во внутреннюю полость (Рисунок 3.40). на Рисунке 3.40 показано, что основной элемент первых ворот – это177основание G8 петли TGT, в то время как движения остатка Т9 не меняются входе связывания катиона с аптамером (серая линия на Рисунке 3.40).Расстояние, нмА)4.03.02.01.0020406080Время, нс.Расстояние (нм)Б)0.80.60.40.2020406080100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320время, нсВ)Расстояние, нм100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 32010.80.60.4020406080100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320время, нсРисунок 3.40: Поведение TGT петли при связывании катиона калия израствора.
Прерывистая линия отражает расстояние между центрами массатомов О6 гуанинов квадруплекса и катионом калия. Сплошная чёрная линияэто расстояние между центрами масс остатка G8 и восьми атомов О6 гуаниновквадруплекса. Сплошная серая линия это расстояние между центрами массостатка Т9 и восьми атомов О6 гуанинов квадруплекса. Проникновениекатиона во внутреннюю полость квадруплекса (прерывистая линия достигаетнулевых значений при 82 наносекунде наблюдения) коррелирует с движениемG8 но не T9.
Катион калия не был замечен в плоскости квартета.Во второй системе, с КСl, аптамер не захватывает ни одного катиона калия из раствора до 129 нс, после чего структура аптамера теряет организацию178(Рисунок 3.41). G-стебель разделяется на две части и расстояние между нимидостигает 10Å. В результате образуется большая пора, в которую катион калияс лёгкостью проникает между плоскостями квартетов (Рисунок 3.41).Рисунок 3.41: Стереоизображение проникновения катиона калия вцентральный связывающий сайт через пору, образуемую при измененииструктуры квадруплекса (стерео-изображение).
Время наблюдения (сверхувниз): 128, 129, 130 и 131 нс.179После этого квадруплекс полностью восстанавливает нативную структуруменее чем за 1 нс и остается стабильным до конца наблюдения.Вклад петель связывание катионовОписанные выше наблюдения показывают, что TGT-петля играет важнуюроль во взаимодействиях аптамера с катионами, находящимися в растворе. Дляболее детального изучения роли TGT-петли мы провели моделирования МД аптамера 15-ТВА без TGT-петли в водном растворе с NaCl. Из 11 расчетных систем одна система в начальной конфигурации содержала катион в центральномсайте связывания, остальные 10 содержали катионы только в растворе. В четырёх системах из десяти модифицированный аптамер потерял структурную организацию в течение первых 10 нс наблюдения и тем самым возможность захватакатиона.
В тех случаях, когда захват катиона происходил очень быстро (0–6 нс),аптамер сохранял структуру квадруплекса и, захватив катион, был стабилен доконца наблюдения (60 нс) – как и система с катионом в центре квадруплексаизначально. Таким образом, TGT-петля вносит важный вклад в стабильность15-ТВА. С одной стороны, отсутствие TGT может ускорять захват квадруплексом катиона из раствора, так как верхний квартет становится полностью доступен для молекул растворителя. С другой стороны, удаление TGT-петли сильноснижает структурную стабильность квадруплекса без катиона в центральномсайте связывания.
Мы считаем, что второй фактор явно превалирует над первым, так как по результатам моделирования вероятность распада структуры ещёдо захвата катиона составляет 40%.Аналогичные алгоритмы использоавны и при исследовании роли ТТ–петельв захвате катиона: ТТ-петли удаляли из молекулы 15-ТВА и проводили моделирование МД по захвату катиона в растворе с NaCl. Из 11 построенных си180Система, катион15-TBA, Na+15-TBA, Na+без TGT 15-TBA,Na+без TGT 15-TBA, Na+без TGT 15-TBA, Na+без TGT 15-TBA, Na+без TGT 15-TBA, Na+без TGT 15-TBA, Na+без TGT 15-TBA, Na+без TT 15-TBA, Na+без TT 15-TBA, Na+без TT 15-TBA, Na+без TT 15-TBA, Na+без TT 15-TBA, Na+Связывающий сайтнижнийнижнийверхнийверхнийверхнийверхнийнижнийверхнийверхнийнижнийнижнийверхнийнижнийнижний время для 1:1,нс898.7898.757.059.859.859.859.559.559.558.856.357.757.757.0 время для 2:1, нс55.25.3138.836.81.70.42.613.02.88.219.313.43.314.4вероятность0.060.00590.680.620.0280.0670.0440.220.0470.140.340.230.0570.25Таблица 3.5: Вероятность существования комплекса аптамера с двумякатионами натрия, когда один из катионов находится в центральномсвязывающем сайте.
Таблица представляет все индивидуальные явления когданаблюдалось связывание двух катионов ( [1]+(1) ).стем одна исходно несла катион в центральном сайте связывания, в остальныехкатион присутствовал только в растворе. Потеря структуры квадруплекса наблюдалась только в двух случаях из десяти. Если катион захватывался структурированной ДНК, то квадруплексная структура сохранялась до конца временинаблюдения.
Во всех стабильных системах захват катиона происходил в диапазоне 2–6 нс наблюдения.В используемой временной шкале не наблюдали обмена катиона, связного саптамером, на катион из раствора, однако обнаружены промежуточные структуры, в которых катион был связан в верхнем (7 раз) или в нижнем (5 раз) связывающем сайте, в то время как структура аптамера была близка к нативной и другойкатион находился в центральном связывающем сайте. В таких структурах, повидимому из-за отталкивания положительных зарядов, катион в центральнойполости был смещен в сторону плоскости квартета, противоположного тому, скоторым связался второй катион.
Статистика о продолжительности этого явления приведена в Таблице 3.5. Через некоторое время катион верхнего/нижнегосвязывающего сайта диссоциировал от квадруплекса в раствор.181Подробный анализ траекторий нативного аптамера 15-ТВА выявил толькоодно событие, когда второй катион связывается аптамером: при связывании катиона в нижнем сайте относительная вероятность найти второй катион, связанным в нижнем сайте составляла 0.06. Для системы без ТТ-петель обнаруженоодно событие, когда произошёл полный обмен катионов за связывание с квадруплексом: на 45-й нс траектории МД один катион из раствора приблизилсяк верхнему связывающему сайту (Рисунок 3.42), что привело к выталкиваниюкатиона из центрального связывающего сайта. В течение очень короткого промежутка времени наблюдается образование комплекса 1 : 2 между ДНК и катионами, причем очень похожий на тот, который описывали Marathias и Bolton[349].
Новый катион входит в центральную полость и через некоторое время(3.5 нс) катион, который исходно находился в центральном связывающем сайте, переходит из комплекса с ДНК в раствор.Рисунок 3.42: Обмен катионами натрия между модифицированным аптамером15-ТВА (без ТТ-петель) и солевым раствором. На рисунке представленыконфигурации системы в ходе моделирования. Исходно связанный катионотмечен серой сферой, а ``приходящий'' – черной сферой.Таким образом, впервые методами моделирования показана возможностьобмена катионами между квадруплексной ДНК и раствором только за счёт теплового движения.
Ранее при моделировани МД по профилям свободной энергии [117; 344; 363] было высказано предположение, что квадруплекс в свободном состоянии всегда связан с катионом. Результаты этой работы расширяют наше понимание общей картины связывания квадруплексами катионов.По-видимому, короткие или смещённые квадруплексы способны вытолкнуть182свяанный с ними катион при кратковременном связывании второго катиона израствора. И этот механизм чисто электростатическй по сути – отталкиваниедвух катионов, лежащих на одной линии, приводит к сначала к смещению связанного катиона и затем к выходу его в растворитель.
Однако связывание катиона из раствора выход другого в раствор не уменьшает вероятность дестабилизации квадруплекса во время этого процесса.Анализ занятости состояний связанных катионов и оценки энергийОсновная цель моделирования МД – это исследование динамики структурывыбранной системы. Конечно, очень важно дополнить общую картину данными по изменению свободной энергии.
К сожалению, метод моделирования МДне позволяет следить за относительным изменением общей свободной энергииво время расчёта. Надо отметить, что общая энергия системы сильно флуктуирует, в то время как кинетическая энергия системы корректируется алгоритмомтермостатирования. Это является основной причиной, почему нельзя рассчитывать изменение свободной траектории во время моделирования. Кроме того,очень важна конфигурация системы, а именно, фазовое пространство для микросостояний системы.Моделирование МД основано на гипотезе эргодичности, где постулируется,что среднее статистическое по ансамблю равно среднему значению во временидля системы – что можно отслеживать в ходе моделирования МД.
Например, набор состояний положения катионов в очень длинной траектории должен достаточно точно описывать обмен катионами между разными микросостояниями и,следовательно, может использоваться для расчёта разницы свободной энергиимежду микросостояниями. Такой подход расчёта изменения свободной энергииявляется единственно правильным с физической точки зрения.183Есть методы, которые позволяют следить за свободной энергией системыне напрямую, а приблизительным образом, используя анализ конформаций после расчёта. Такие подходы экстрагируют координаты исследуемого объектаиз траектории, удаляют молекулы воды и заменяют их описанием растворителя в неявном виде, например, с помощью теории Пуассона-Больцмана. С переменным успехом этот подход активно использовался для исследования Gквадруплексных ДНК некоторое время назад [339; 364].
Подобные расчёты вносят дополнительные значительные приближения к уже сделанным в ходе моделирования МД – в итоге получаемые значения содержат значительные систематические и случайные ошибки.Учитывая все эти ограничения, мы решили не использовать подобные методы для исследования изменения свободной энергии в ходе взаимодействия аптамера 15-ТВА с катионами, а следить за некоторыми компонентами свободнойэнергии, к примеру, за энергией взаимодействия ДНК и катиона, на основе приближений силового поля. Такие расчёты проводились ранее, например Boltonи коллегами [266] . Такой расчёт не учитывает как эффект растворителя, таки энтропийный фактор, и результат не обязательно коррелирует с изменениемсвободной энергии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
