Конформационная динамика нуклеиновых кислот при взаимодействии с лигандами (1098269), страница 25
Текст из файла (страница 25)
В ходе динамики дестабилизированной структуры ее разрушение апрямую зависит от подведенияТТ-петель. Когда основание Т9 не вовлечено в стэкинг с верхним квартетом,TGT-петля не может сбалансировать дестабилизирующее напряжение от ТТпетель. Заметим, что более точное описание взаимодействия с катионом можетнесколько изменить баланс сил, хотя данные по мутагенезу 15-ТВА косвенноподтверждают сделанные нами выводы о роли TGT-петли.Кроме того, полученные нами результаты свидетельствуют о важностистэкинг-взаимодействий между квадруплексом и минимум двух нуклеотидовTGT-петли, а именно: G8 и T9.
Только нуклеотид Т7 TGT-петли оказался невовлечен во внутримолекулярные взаимодействия. По все видимости, его рольчисто структурная – создание достаточной длинны петли, соединяющей тяжиквадруплекса. Ранее Smirnov и коллеги [329], а также Griffin и др. [330] выяснили, что оптимальная длина этой петли составляет три нуклеотида. Нами выявлено дестабилизирующее действие ТТ-петель на G-квадруплексный стебель.Один их факторов – изменение угла закрутки квадруплекса (Рисунок 3.29). Видимо, длины ТТ-петель недостаточно для оптимальной геометрии квадруплекса и это вызывает напряжение в структуре.
Заметим, что в ходе моделированияЯМР-структуры 15-ТВА ТТ-петли существенно меняют конформацию (Рису157нок 3.30). Это значит , что в исходной модели в ТТ–петелях было напряжение,которое релаксировало в ходе моделирования МД. Может быть два объяснения наблюдаемому эффекту. Первое – стартовая структура не идеальна и в ходе моделирования происходит ее оптимизация. Второе – геометрия петель вквадруплексе может неточно воспроизводиться приближениями для построения силового поля, как это ранее показано в литературе [312]. Это означает,что в ходе моделирования МД происходит оптимизация структуры аптамераотносительно стартовой геометрии, но это улучшение имеет смысл в терминах используемого силового поля. Интересно отметить, что при моделированииЯМР-структуры с выведенным из стэкинга основанием Т9 при релаксированном состоянии ТТ-петель структура аптамера оказалась высокостабильной и входе моделирования нативное положение нуклеотида Т9 восстановилось.
Аналогичный результат получен и при моделировании системы, где одновременноизменялись положения G8 и T9. Таким образом, оптимизация геометрии ТТпетель приводит к общей стабилизации структуры аптамера 15-ТВА.ТТ-петли также играют критическую роль при связывании с тромбином. Если РСА-конформация аптмера верна, то связывание с тромбином происходитпри участии TGT-петли. Несмотря на множество контактов, которые образуетТТ-петли с белком и которые могли бы стабилизировать квадруплекс, дестабилизирующее действие этих петель четко выражено. С другой стороны, в случаеЯМР–модели 15-ТВА, его ТТ-петли взаимодействуют с тромбином и этот контакт уменьшает напряжение G-стебля аптамера по сравнению с динамикой свободного соединения в растворителе.
Это видно по данным для значений угла закрутки квадруплекса (Рисунок 3.29). Из этого следует, что ЯМР–модель лучшеотражает структуру комплекса 15-ТВА с тромбином [331]. При моделированииМД комплексов аптамер-тромбин в стехиометрии 1 : 2 показано, что эти струк158туры стабильны и имеют право на существование. В комплексе 1 : 2 с аптамеромв РСА-конформации показана рольТТ-петель на взаимодействие с тромбином.Множественные контакты ТТ-петель с белком по экзосайту 2 предотвращаютразрушение структуры аптамера в течение всего времени наблюдения (600 нс).Однако Tsiang и коллеги показали, что мутации в экзосайте 2 не изменяют ингибирующей активности аптамера, что свидетельствует о том, что аптамер невзаимодействует сэкзосайтом 2 тромбина [332].G-стебель в ЯМР-структуре 15-ТВА находится в явном напряжении из-заТТ-петель (значимо изменены углы закрутки квадруплекса по сравнению с бесптелевой структурой). По результатам моделирования можно предположить,что TGT-петля стабилизирует квадруплекс, в то время как ТТ-петли вносятнапряжение в структуру.
Baldrich и др. показали [331], что при связываниитромбина наблюдается уменьшение структурного напряжения, вызванного ТТпетлями в молекуле аптамера. Необходимо подчеркнуть, что все сделанные нами умозаключения строятся только на анализе моделирования МД, результатыкоторого хорошо согласуются с экспериментальными данными.
Мы не предпринимали попыток провести моделирования с расчётом свободной энергии,так как у нас нет подходящего прямого метода для расчётов с приемлемой точностью. В 2010 году в проводимом нами исследовании использовано время наблюдения, которе на 1-2 порядка превосходило известные способы моделировании МД для G-квадруплексных ДНК. Считается, что достоверность МД напрямую зависит от длины траектории. Итак, если обобщить полученные приМД-моделировании результаты, то можно сделать следующие выводы.1.
В целом, петли стабилизируют структуру квадруплекса в составе 15-ТВА.Однако ТТ-петли, с одной стороны, способствуют сближенности тяжей159квадруплекса, с другой – дестабилизируюют его структуру. И это связанос их длиной. Влияние TGT-петли только стабилизирующее.2. ТТ-петли участвуют в узнавании тромбина и при связывании белка уменьшается структурное напряжение в G-квадруплексе, приближая его геометрии к оптимальному состоянию.3. Согласно данным моделирования МД, ЯМР-структура аптамера15-ТВАлучше отражает реальную структуру его комплекса с тромбином и экспериментальные данные, чем РСА-структура.Полученные результаты будут полезны при конструировании биосенсорови дизайне лекарственных препаратов на основе аптамера 15-ТВА.1603.5Взаимодействие аптамера 15-ТВА с катионамиМы уже обсуждали, что правильно упакованный мономолекулярный Gквадруплекс без катиона в центральной полости может быть стабильным примоделировании МД в явно заданном растворителе в течение временного интервала, достаточного для захвата катиона щелочного металла из раствора.
Вопрос о координации катиона в аптамере 15-ТВА тоже обсуждался. На моментисследования данные о положении и числе катионов, способных связаться с аптамером, были противоречивы. Мы детально исследовали координацию катионов в 15-ТВА и механизмы проникновения катионов во внутреннюю полость.Кроме того исследованы механизмы взаимодействия одновалентных катионовс G-квадруплексами.
Ранее в экспериментальных данных выявлено, что длинаи состав петель влияют на структурную стабильность G-квадруплексов и эффективность их сборки [333—336], Однако полного понимания факторов, которые направляют самосборку квадруплексной структуры, не было. Известно,что формирование квадруплексной структуры зависит от заряда и размера катиона, который связывается в центральной полости стебля. Так, катион натрияможно обнаружить в двух положениях: в центральной полости между квартетами и в плоскости одного из квартетов [337; 338].Катионы большего размера такие как К+ и NH4 + не могут находиться в плоскости кварта по стеричиским соображениям – так что они стремятся расположиться симметрично между прилегающими квартетами – по центру. Большинство известных на сегодня G-квадруплексных структур получены методомЯМР, возможности которого сильно ограничены для получения информации оположении катионов металлов.
В целом современные экспериментальные методы дают ограниченную информацию о динамическом поведении катионов,161связанных в центральной полости квадруплекса. Моделирование МД становится удобным инструментом для исследования G-квадруплексных структур [117;133; 143; 149; 339—346].При МД-моделировании общая картина взаимодействия катионов с Gквадруплексными ДНК достаточно реалистична [347]. В ЯМР-исследованииструктуры 15-ТВА в присутствие катионов стронция выявлено наиболее вероятное место связывания этого катиона –центральная полость G-стебля и позиция между плоскостями квартетов. При такой геометрии связывания катионкоординируется восемью атомами кислорода, О6, азотистых оснований гуанинов квадруплекса [348].
В другой работе исследовали взаимодействие с аптамером двух катионов калия [349; 350]. Один катион располагается между верхнимквартетом и TGT-петлей (в дальнейшем мы будем называть это место ``верхнийсайт связывания калия'', или ``верхний сайт'') или между нижним квартетом иТТ-петлями (далее ``нижний сайт связывания калия'', или ``нижний сайт'').В 2009 году Плавец и коллеги прямо показали место связывания катиона15NH4 + с 15-ТВА, используя ЯМР и другие спектроскопические методы [351].Полагая, что квадруплекс в присутствии катионов амония и калия имеет одну и ту же топологию, авторы исследовали различия в положении нуклеотидовпетель. Оказалось, что структура петель мало зависит от природы выбранныхкатионов. Было показано, что катион аммония связывается в центральной полости квадруплекса и между квартетами (в дальнейшем мы будем называть это место связывания ``центральным'').
Кроме того был обнаружен сигнал, которыйсоответствовал связыванию катиона в нижнем сайте – его интенсивность былав 10 раз слабее, чем сигнала из центрального сайта. Рядом с TGT-петлей катион аммония не зарегистрирован.Амоний может образовывать как водородныесвязи с карбонильными атомами азотистых оснований гуанина, так и электро162статические контакты. Это накладывает очевидные ограничения на взаимноерасположение доноров и акцепторов водородной связи.
Катион калия образуеткак координационные, так и электростатические взаимодействия, требованиякоторых к геометрии расположения участников менее жесткие. В дополнение,методом плавления с ультрафиолетовой детекцией, было показано, что аптамер к интегразе ВИЧ (Т30923), который образует сходный с 15-ТВА по топологии квадруплекс, вероятно связывает три катиона калия во всех трёх сайтах:нижнем, центральном и верхнем [352]. Вся эта информация не позволяет дажеоценить вероятное положение катиона калия в структуре 15-ТВА.Нами проведено исследование атомистической картины взаимодействия катиона металла с аптамером 15-ТВА с использованием методов МД в явно заданном растворителе (более 30 индивидуальных траекторий), гибридного методамолекулярной динамики/квантовой механики (МД/КМ) и экспериментальнойвалидации методом изотермической калометрии (ИКТ).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
