Конформационная динамика нуклеиновых кислот при взаимодействии с лигандами (1098269), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Мы использовали моделированиеМД в явном растворителе как инструмент для анализа роли ``петельных'' нуклеотидов в стабильности всей структуры. Нами исследована стабильность положения атомов в зоне контакта для двух вариантов структуры.Моделирование МД активно используется для исследования структур, содержащих G-квадруплексы [310—315]и стало удобным инструментом для получения атомистической информации о динамических свойствах молекул. Метод МД основан на наблюдении за эволюцией структуры в условиях, максимально приближенных к физиологическим, в том сичле и по временны рамкам. Важным моментом в подобного рода моделировании является достоверное описание взаимодействий, в которых участвуют атомы исследуемой молекулы.
Совокупность параметров, с помощью которой описывают некий классмолекул, например биополимеры, называют силовым полем. При моделировании на основе силовых полей не учитывается электронная плотность атомов вявном виде, а используются разнообразные аналитические функции, параметры которых адаптируются для воспроизведения экспериментально полученныхпараметров системы.Современные силовые поля, такие как parm99 [316; 317] и его модификации,достаточно точно описывают поведение G-квадруплексного стебля.
Показано,что диагональные и пропеллерные типы петель моделируются методами МД нетак достоверно, как квадруплексная часть структуры [310—312].В 2007 году была опубликована модификация силового поля parm99 с названием parmbc0 [318]. Это обновленное описание сильно улучшило результаты моделирования В-ДНК при длительном времение наблюдения ториях. Длина траектории (время наблюдения за системой) является важным параметром136моделирования: чем дольше наблюдение за системой, тем более вероятно, чтосистема пройдёт все состояния, свойственные равновесным. Для нового поляparmbc0 показано, что на длительных траекториях это силовое поле хорошоописывает как канонические, так и неканонические структуры НК [318; 319].Улучшен и алгоритм описания одноцепочечных участков ДНК – таких как петли в 15-ТВА.
Однако это улучшение не означает сиюминутного получения идеальных результатов [312].К началу проведения исследования была доступна информация о двух способах моделирования МД 15-ТВА. Pagano и коллеги показали [309], что моделирование в коротком временном диапазоне (5 нс) дает стабильные структурыкак 15-ТВА, так и его модификаций в силовом поле parm98. Результаты моделирования согласовывались с данными ЯМР, которые и были источником поконформации олигонуклеотида. Это означает, что в в 5нс-интервале наблюдения изменения структуры не происходило. Отметим, что этого времени недостаточно для наблюдения существенных структурных изменений в молекулетакого размера.
Поведение петель согласовывалось с данными ЯМР. В работе,выполненной Jayapal и коллегами[240] , показано, что нарушенная структура15-ТВА возвращается к исходной после 2 нс моделирования в силовом полеOPLS-AA с записями для НК (ранее эти записи были добавлены нами к стандартному полю OPLS: см. http://rnp-group.genebee.msu.su/3d/ff.htm).Построение моделейДля моделирования МД были выбраны две известные конформации аптмера 15-ТВА.
Для анализа конформации по данным РСА были взяты координаты атомов соответствующие аптамеру в комплексе с тромбином (PDBID:1HUT)137[306]. В качестве стартовой конформации по данным ЯМР были использованыкоординаты аптамера из записи банка PDBID:148D [305].Для сравнительного анализа влияния петель на динамические свойстваструктуры использована ЯМР-структура, из которой удалены записи о координатах атомов в петлях. Также исследованы конформации полученных обоимиметодами структур, в которых изменено исходное положение остатков в TGTпетле. Эти модификации названы соответственно TG(-T), T(-GT) и TG(+T).
Знаки '+' и '-' означают изменение положения остатка относительно начальнойконфигурации, где '+' – это вовлечение в стэкинг взаимодействие с прилежащим G-квартетом, в то время как, '-' – это разрушение существующего стэкингас квартетом. Подобные модели получали на основе известных из PDB конформаций аптамера путем вращения остатки нуклеотидов G8 и Т9 относительноуглов , и в программе молекулярной визуализации PyMol версии 1.1.Внесённые изменения требовали оптимизации геометрии структуры в вакууме, что было реализовано модифицированным квази-Ньютоновским алгоритмом BFGS (Broyden–Fletcher–Goldfarb–Shanno)[320] с органичным использованием памяти.
Таким образом исключили из рассмотрения слабые (высокоэнергетичные) взаимодействия. Для моделирования комплекса аптамера с тромбином как в ЯМР (PDBID: 1hut), так и РСА (PDBID: 1hao) конформациях, протонирование ряда остатков типа: аспартат, глутамат и гистидин – проведеносогласно экспериментальным данным Ahmed и коллег[321] .
Все другие аминокислотные остатки тромбина имели состояние протонированости, соответсвующее их pKa в физиологическом растворе. Для комплекса аптамера с тромбином в соотношении 1 : 2 на основе исходных структур комплексов были построены модели, где вторая молекула тромбина ``поступала'' из соседней ячейки – при этом сохранялась и группа симметрии, и расстояние между аптамером138и тромбином (не более 4Å).
Из найденных ``соседей'' отбирали ту молекулутромбина, которая взаимодействовала с аптмером по экзосайту 2. Все операции проводили в программе PyMol.Рисунок 3.22: Модель комплекса тромбин–15-ТВА с соотношением 2 : 1.Взаимодействие тромбина (исходная структура отмечена жёлтым и буквой А)с аптамером (красный) через экзосайт 1 (зелёные сферы). Второй тромбинотбирали на основании близости расположения экзосайта 2 (отмеченголубыми сферами) к аптамеру. Среди всех возможных ``соседей'' покристаллической решётке (отмечены более бледным) только одна молекулатромбина удовлетворяет установленным критериям (отмечена буквой В)3.4.1Аптамер 15-ТВА, ЯМР и РСА конформации.При моделировании молекулярной динамики происходит эволюция во времени выбранной конфигурации при учёте кинетической энергии атомов призаданной температуре. Это означает следующее: если конформация не соответсвует оптимальной, то при моделировании, скорее всего, она будет значимо из139мененяться.
причем с потерей геометрии, соответствующей структурному элементу. Для такой небольшой молекулы как 15-ТВА этим элементом являетсяквадруплекс. В предварительном исследовании нами показано, что наблюдение за аптамером в воде в течение 100 нс не приводит к значительному изменению геометрии квадруплекса, но наблюдается разница в амплитуде движениягуаниновых оснований как в плоскости, так и вне плоскости квартета для РСАструктуры. Очевидно, что возможное разрушение структуры квадруплекса лежит за пределами 100 нс–интервала моделирования МД. В расчётах мы сделали упор на наблюдение факта разрушения именно квадруплексной структуры.Выбранная нами длина траектории в 900 нс проверена в серии экспериментов , которые показали.
что разрушение структуры квадруплекса происходитпри отсутствии стабилизирующего катиона в центре квадруплекса. Как сказано выше, мы использовали два силовых поля для моделирования МД: parm99 иparmbc0. Хотя к началу исследования РСА–структуру считали ошибочной, мывсё-таки расценивали конформацию 15-ТВА в ней как одну из возможных.
Входе моделирования РСА-модель полностью потеряла структуру квадруплексав обоих силовых полях. В обоих случаях потеря структуры проходила по одному сценарию: Т4 и Т13, которые принадлежат разным ТТ–петлям, вовлекаются в стэкинг-взаимодействия друг с другом, нарушая планарность нижнегоG-квартета.
В силовом поле parm99 структура продолжает сохранять элементыквадруплекса вплоть до 190-нс траектории МД, в то время как в силовом полеparmbc0 структура квадруплекса теряется в течении 10 нс (Рисунок 3.23).ЯМР-структура сильно отличается от РСА-модели. На протяжении всеговремени наблюдения, 900 нс, конфигурация аптамера остаётся близкой к исходной в обоих силовых полях – за исключением перестройки в контактах тиминовиз ТТ-петель внизу квадруплекса.
В силовом поле parmbc0 водородные связи1400.8СКО, нм0.60.40.200100200300400500600700800900Время, нсРисунок 3.23: РСА конформации аптамера в соответствующие моментытраектории на графике временной зависимости СКО всех атомов текущейструктуры относительно стартовой. Первое изображение соответствуетстартовой структуре.Т4–Т13 ``переключаются'' на Т4–Т12 и формируется контакт Т3–Т13. Однакоподобная конфигурация ТТ-петель не очень стабильна и может переключаться обратно – на Т4–Т13 контакт.
Такая подвижность ТТ-петель может иметьпринципиальное значение для образования комплекса с тромбином – атомы оснований Т4 и Т13 аптамера не задействованы в связывании с белком и потомунебольшое изменение их позиции не влияет на этот процесс. В поле parm99контакты Т4–Т13 переключаются на Т4–Т12, в то время как Т13 находится встэкинге с нижним квартетом, а Т3 образует выпетливание в сторону растворителя (Рисунок 3.24).141Рисунок 3.24: Вид снизу конечной структуры аптамера после моделированияструктуры на основе ЯМР данных. Структурная организация ТТ-петель вЯМР-модели зависит от используемого силового поля. В случае parm99(слева) основание Т3 экспонировано в раствор. После нескольких перестроек(через 200 нс) основания ТТ-петель могут организовать такую же структуру,как и в случае силового поля parmbc0 (справа).
Далее (через 820 нс) этаструктура превращается в ту, которая представлена на рисунке. В полеparmbc0 все тимины склонны к стэкинг-взаимодействию с нижним квартетоми формированию двух ТТ-пар: Т3–Т13 и Т4–Т12. Такая геометрия петельдостигается достаточно быстро и остаётся на протяжении всего временимоделирования.3.4.2Почему ЯМР структура более стабильна чем РСА модель?Как обсуждалось ранее, интерпретация РСА-комплекса считалась ошибочной – так что потеря квадруплексной структуры при моделировании МД вполнелогична. Это стало первым случаем ``разрушения'' представленной в банке PDB квадруплексной структуры.
С одной стороны, моделирование простопредполагает, что одна условно изолированная молекула не имеет стабильнойструктуры, что нельзя напрямую экстраполировать на эксперимент, так представленность данной конформации может помешать её детекции в растворе методом ЯМР. С другой стороны, стабильность ЯМР-модели в при достаточно142длительном наблюдении позволяет предположить приемлемое качество описания аптамера в силовом поле parmbc0. Самое важное здесь то, с помощьюмоделирования можно понять, какие силы и факторы влияют на формированиеструктуры аптамера. Понятно. что данные такого рода не получают экспериментальным путём.Используя разные стартовые конформации, мы попытались определитьроль основных структурных элементов аптамера: стебля, петель и их взаимное влияние – на образование комплекса с тромбином.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
