Конформационная динамика нуклеиновых кислот при взаимодействии с лигандами (1098269), страница 21
Текст из файла (страница 21)
В таких структурах геометрия квадруплексов довольно жестко ограничена значениями углов19∘ ±4∘ , что все же ближе к приемлемым для беспетлевых квадруплексов. Таким образом, можно заключить, что напряжения, создаваемые латеральнымипетлями, сильнее создаваемых петлями диагонального типа.Важно, что часто используемый в описании квадруплексов паттернсин/анти-конформаций, в группе бимолекулярных квадруплексов с диагональными петлями представлен наибольшим числом возможных комбинаций.
В тоже время, именно в этой группе разброс значений углов закручивания квадруплексов наименьший. Это позволяет предположить, что доминирующим фак129тором влияния на структуру квадруплекса является тип петель. Пропеллерныепетли наиболее жестко определяют геометрию квадруплекса. Как в одномолекулярных, так и бимолекулярных тетраплексах с петлями исключительно пропеллерного типа значения углов закручивания находятся в пределе 31∘ ±3∘ . Даже появление в этих структурах латеральных петель мало влияет на закручивание прилежащих к пропеллерным петлям областей – оно попадает в областьзначений 28∘ ±4∘ , а значит вписывается в интервал предпочтительных значений для беспетлевых квадруплексов (27∘ - 34∘ ).
Видимо, такие углы закручивания соответствуют оптимальной геометрии G-квартета, поскольку тетрадыструктур с петлями пропеллерного типа отличаются высокой планарностью отквадруплексов с диагональными петлями.Нами исследованы все известные на данный момент G-квадруплексныеструктуры. Их кластеризуют не только по топологии; многие группы представлены последовательностями общего или родственного происхождения. Заметим, что в итоговую версию вошли не все структуры – часть из них обладаетслишком специфичной топологией, чтобы составить представительную выборку. Для описания геометрии квадруплексов мы предложили два параметра: уголзакручивания тетраплекса и степень планарности G-тетрад – и показали, чтоосновным источником напряжений в структуре квадруплексов являются петли,соединяющие блоки G-тяжей.
Петли латерального типа наиболее сильно изменяют геометрию G-квадруплексов, однако, их воздействие компенсируется добавлением в структуру петель диагонального и пропеллерного типа. Петли диагонального типа также достаточно жестко определяют структуру квадруплекса,однако создаваемые ими напряжения не столь велики, как в случае с латеральными петлями. Оптимальной же геометрией характеризуются квадруплексы спетлями пропеллерного типа.130Очевидный интерес для дальнейшего детального исследования динамикицелостной молекулы НК представляют небольшие квадруплексы с дестабилизирующими петлями. Такой выбор позволит охарактеризовать весь спектр конформационных превращений молекулы в процессе ее функционирования.1313.4Исследование динамики структур аптамера ктромбинуАптамеры – это молекулы ДНК или РНК, отобранные из рандомизированых библиотек нуклеотидных последовательностей, проверенных на способность связываться с заранее заданным лигандом.
Для полноты картины, надозаметить, что термин ``аптамер'' распространяется не только на НК – сейчасактивно развивается область исследований по пептидным аптамерам. Важноотметить, что размер вариабельной части последовательности, не превышает60 пар нуклеотидов. Размер лиганда бытьне играет роли – это может быть каквысокомолекулярное соединение, так и низкомолекулярное. Ключевой моментотбора – стабильность третичной структуры лиганда.Найдены аптамеры даже к таким гигантским объектам как клетки А размер клетки не сопоставим с размером небольшой нуклеиновой кислоты! В этомслучае отбор идёт не на клетку целиком, а на некоторый набор детерминант, доступных для взаимодействия с аптамером, на поверхности клетки.
Процедураотбора подразумевает циклическое обогащение смеси и последующую амплификацию ``успешных'' последовательностей-кандидатов [303]. В связи с тем,что ни одну из исходных библиотек нельзя считать понлй, то и результаты селекции далеки от оптимальных. Несмотря на это, на сегодняшний день найденыдесятки последовательностей ДНК и РНК, способных эффективно связыватьсяс заданными мишенями.Одним из таких достижений стал аптамер к тромбину.
Тромбин – это сериновая протеиназа, которая реализует расщепление фибриногена и высвобождение фибрина – основного компонента тромба. Одна из причин успеха связананепосредственно со строением этого белка – наличие на его поверхности двух132зон с положительным зарядом., Так что образование эффективного комплексамежду тромбином и отрицательно заряженным остовом НК вполне объясним.Первая плюс-зона тромбина называется экзосайт 1 – здесь происходит связывание фибриногена.
Вторая плюс-зона называется экзосайт 2 – тут связываетсягепарин.Рисунок 3.20: Третичная структура тромбина. Зеленым отмечен экзосайт 1,голубым экзосайт 2. Каталитический сайт представлен в виде сфер атомов,которые окрашены в следующие цвета: О – красные, С – белые, N – синие.Известно множество вариантов аптамеров к тромбину [237; 304] . Самымизученным на сегодня является 15-звенный олигонуклеотид с последовательностью d(GGTTGGTGTGGTTGG), также известный как 15-ТВА.
Ключевойструктурной детерминантой этого аптамера является G-богатая последовательность. которая в растворе образует квадруплексную структуру из двух плоскихG-квартетов, расположенных друг над другом. Образуемый квадруплекс отно133сится к мономолекулярному типу, т.е. состоит из одной цепи. Реализации подобной структуры квартеты обеспечивается тремя латеральными петлями. Двеиз них состоят из двух тиминовых нуклеотидов, а третья содержит последовательность TGT.
Несмотря на обилие данных [266; 268; 305; 306] по этому аптамеру и его взаимодействию с тромбином, атомистический механизм узнаваниятромбина аптамером не изучен.На момент выполнения работы были доступны две модели комплекса аптамера с тромбином, которые основаны на данных ЯМР и РСА c [305; 306].Структура аптамера в этих двух комплексах сильно различалась – несмотря наналичие G-квартетов – и направлением цепи и геометрией петель. Уже на тотмомент считалось, что структура, полученная по данным РСА, не отражает реальную картину. Модель комплекса, построенная на основе данных ЯМР, больше соответствовала и значениям электронной плотности, полученным методомРСА, как исходя из величин R-фактора, так и при сравнении электронной плотности модели и экспериментальных значений [307].Итак, есть два варианта модели третичной структуры комплекса тромбин–аптамер 15-ТВА.
Из-за различий в структуре аптамера зона его контакта стромбином тоже различна. В ЯМР-модели ТТ-петли аптамера взаимодействуют с экзосайтом 1 тромбина, в то время как в РСА-модели TGT-петля аптамераобразует контакт с тем же экзосайтом 1 тромбина [306].Попытки разрешить это противоречие с помощью сайт-направленного мутагенеза аптамера не удались. Изменения в ТТ-петлях однозначно влияли наэффективность связывания с тромбином, но и мутации в TGT-петле тоже приводили к потере ингибирующей способности аптамера. Стехиометрия взаимодействия тромбина с аптамером также ``не лежит на поверхности''. Bock и Tasset[237; 308] предполагают стехиометрию комплекса как 1 : 1.
На основе данных134Рисунок 3.21: Слева: Модель на основе ЯМР. Справа: модель на основе РСА.Два G-квартета, верхний квартет образован остатками G1, G6, G10 и G15.Нижний квартет образован остатками G2, G5, G11, G14. Остальныенуклеотиды образуют три латеральных петли: одну TGT и две TT.Противоположные стороны квадруплекса образуют подобные бороздки.Красным выделены малые бороздки, синим выделены большие бороздки.Модели 15-ТВА отличаются как направлением цепи, так и топологией цепей.В ЯМР модели, два азотистых основания G8 и Т9 из TGT петли образуютстекинг взаимодействия с верхним квартетом.
Азотистые основанияучаствующие в стекинге отмечены серыми прямоугольниками. ОснованияТ4-Т13 образуют ТТ пару с двумя водородными связями, стабилизируя ТТпетли. В модели полученной на основе данных РСА, причём основание G8вступает в стекинг взаимодействие с верхним квартетом. ТТ петли невзаимодействуют друг с другом.РСА, Padmanabhan и др. [306] полагают, что 15-ТВА может взаимодействоватькак по экзойсайту 1, так и через границу кристаллической ячейки с экзосайтом 2 соседней молекулы тромбина. В пользу этой гипотезы свидетельствуютрезультаты, полученные Pagano и др. [309]. Используя метод изотермическойсканирующей калориметрии, они обнаружили комплексы тромбин-аптамер состехиометрией 2 : 1.Очень важно, что число нуклеотидов в петлях аптамера невелико – и этоуникальная возможность провести структурную аннотацию роли каждого нук-135леотида в формировании структуры аптамера как в свободном состоянии, таки при образовании комплекса с тромбином.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
