Конформационная динамика нуклеиновых кислот при взаимодействии с лигандами (1098269), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Этот стебель, благодаря дегидратации, может быть легко расплетён при движении рибосомы, оставаясь при этом недоступным для химическоймодификации – как это выявлено при сравнении паттернов модификации этогоучастка в комплексе с рибосомой и в свободном состоянии. Защищённая петляА79–А86 прочно удерживается в мРНК-связывающем сайте рибосомы [193],что приводит к изменению конформации первого нуклеотида в кодоне возобновления и как результат к увеличению его доступности для химической модификации.
Арка, которая может быть визуализированна с помощью криоэлектронной спектроскопии состоит из трёх псевдоузлов. Как и в случае тмРНК-2,эта арка окружает голову 30S субчастицы, начиная с плеча. Модель предполагает движение арки вокруг 30S субчастицы, что согласуется с данными криоэлектронной микроскопии (Рисунок 3.5).Спираль 5 расположена рядом со входом в тоннель для мРНК. Третий ичетвертые кодоны открытой рамки считывания тмРНК расположены соответственно в Р- и А-сайтах, что согласуется с данными РСА [193]. Как и ранее, всезащищенные в комплексе остатки тмРНК, находящиеся в одноцепочечных областях, вовлечены во взаимодействие с рибосомой.
Расположение остатков, доступность которых увеличивается при формировании комплекса, соответствуетвозможным нарушениям РНК-цепи. В разработанной нами модели принято во92Рисунок 3.5: Трёхмерная реконструкция комплекса тмРНК-4 с рибосомой наоснове данных криоэлектронной микроскопии. Три индивидуальные частицыс разным положением арки показаны со стороны 30S субчастицы.внимание участие белка SmpB на всех этапах функционирования тмРНК – всоответствии с экспериментальными данными, полученными ранее [175; 195;196].
Однако есть информация о том, что две молекулы белка SmpB могут связываться с рибосомой на пре-инициаторном этапе [179; 197], стимулируя распознавание неактивной рибосомы.3.1.3Оценка достоверности упрощённого моделированияПосле публикации вышеизложенных результатов вышла работа [198], в которой на основе данных метода криоэлектронной микроскопии предложенаполноатомная модель тмРНК в комплексе с рибосомой. Сравнительный анализструктуры этого комплекса с построенной нами моделью выявил достаточно93Рисунок 3.6: Пре-инициаторный комплекс рибосомы: модель иэкспериментальные данные. Серым отмечены субчастицы рибосомы.Положение тмРНК по данным криоэлектронной микроскопии показаносерыми линиями, на основе проведенного моделирования – чёрным.высокую точность моделирования для той области тмРНК, которую мы называем аркой.
и наименьшую – при расположении коротких двуспиральных участков, локализация которых определятся стэкинг-взаимодействиями во внутренних петлях молекулы. Как уже упоминалось, мы пренебрегли такого рода взаимодействиями для того, чтобы иметь принципиальную возможность построитьмодель такого крупного комплекса как тмРНК-рибосома.Необходимо отметить, что для моделей, которые рассмотрены в этой частиработы, данных по структуре ещё не было. Следует сказать, что переход к упрощенному моделированию позволяет достаточно точно локализовать в составе модели крупные структурные элементы, однако, для детального пониманияатомистических механизмов, которые определяют функционирование крупныхНК, необходимо использовать полноатомное моделирование.943.1.4Создание автоматического инструмента для упрощённого моделированияВ этой главе представлены результаты по созданию инструмента моделирования, который может быть унифицирован и распространен для широкогоиспользования.
Нами разработан метод и запущен веб-сервер для моделирования трехмерной структуры малых РНК на основании данных по вторичнойструктуре. Как и ранее, мы оперировали методом пространственных ограничений, который позволяет достаточно однозначно определять параметры ограничений. Это касается двуспиральных участков вторичной структуры РНК, которые в нативных условиях образуют А-форму двойной спирали.
Для петельи выпетливаний можно использовать данные по конформации петель с подобной последовательностью в известных структурах. Важным условием востребованности такого инструмента является возможность получения полноатомных моделей без дополнительного программного обеспечения. Первые варианты нашего сервиса (http://dualopt1.cmm.msu.ru, Рисунок 3.7)были реализованына основе языка Perl, а молекулярно-механистическая часть высчитывалась спомощью программного пакета Gromacs. Предложена модульная схема составления пакета программ, которая позволяет использовать отдельные функции(подпрограммы) независимо друг от друга. Разбиение на модули позволяет создавать гибкую программную среду, которая легко обновляется и дополняетсяпо мере развития.
Подробности алгоритма работы сервиса можно найти в главе``Материалы и методы''.95Анализ результатов тестирования сервисаЦель создания сервиса – попытка частично ликвидировать разрыв в количестве данных между вторичными и третичными структурами РНК. Для реализации этой цели разработан многоэтапный подход к построению модели РНКс упрощенным описанием нуклеотида, на основе которого и создан автоматизированный метод для моделирования трехмерной структуры РНК.
В качествеиллюстрации возможностей метода проведено моделирование 5S рРНК, тмРНКE. coli, а также проанализирована его производительность. Полученные модели соответствуют всем необходимым структурным требованиям, следующимиз описания вторичных структур и информации по структурам этих двух РНК.Это свидетельствует о приемлемом качестве полученных моделей.
Однако следует подчеркнуть, что этот подход помогает построить модель на основе известных данных и практически не обладает предсказательной способностью.Возможность получения дополнительной информации из моделирования подобного рода возникает только при указании пользователем дополнительнойинформации, достаточной для формирования структуры РНК близкой к нативному состоянию. Несмотря на вышеизложенные ограничения, последние модификации нашего сервиса позволяют выполнять широкий спектр операций примоделировании третичной структуры РНК и восстанавливать упрощенные модели до полноатомного состояния.96Рисунок 3.7: Изображение стартовой страницы сервиса для моделированиятрехмерной структуры малых РНК на основании данных по вторичнойструктуре.973.2Конформационная динамика взаимодействиямакролидных антибиотиков с рибосомой3.2.1Взаимодействие производных тилозина в рибосомномтоннелеПри исследовании комплекса тмРНК с рибосомой нами показано, что упрощённое моделирование при достаточном количестве экспериментальных данных может привести к реалистичной модели третичной структуры.
Хорошеесовпадение модели с экспериментальными данными обусловлено тем, что вэтом подходе крупные элементы структуры распределены в ограниченном объеме, так что внутренние стерические ограничения, принятые в рассматриваемой системе, приводят к разумному результату.
В то время как в природе, такаяструктурная организация формируется широким разнообразие нековалентныхвзаимодействий.Используя разработанный подход, мы попытались предсказать активностьпроизводных антибиотиотика, который связывается с рибосомным тоннелем.Важной составляющей этой системы является не сам антибиотик, а собственно рибосомный тоннель – нас интересует потенциальная подвижность нуклеотидов, которые находятся на поверхности тоннеля. На сегодняшний день естьтолько общие представления о функционировании остатков 23S рРНК в рибосомном тоннеле.
Следует отметить, что в отличие от предыдущей задачей, вэтой модели нас интересует подвижность отдельных оснований, а не остоваРНК. Это обусловлено тем, что, согласно данным РСА, в районе рибосомноготоннеля подвижности остова 23S рРНК чрезвычайно низкая. Очевидно, что длярешения поставленной задачи необходимо максимально точно оценить возмож98ные нековалентные взаимодействия между нуклеотидами (в случае же с тмРНКмы определяли местоположение не оснований, а крупных элементов вторичнойструктуры).Итак, кратко опишем объект исследования.
Полипептидная цепь, синтезируемая в пептедилтрансферазном центре рибосомы (ПТЦ), продвигается по рибосомному тоннелю (РТ), или вообще не зашифровывать),по мере того, как кцепи присоединяются новые остатки. Рибосомный тоннель пронизывает тело50S субчастицы насквозь – от ПТЦ до выхода из рибосомы, где растущая полипептидная цепь встречает направляющие факторы и шапероны. Основная рольрибосомного тоннеля – это направление синтезируемой белковой цепи от ПТЦк выходу из рибосомы.
Известны и факты, подтвержающие взаимодействие боковых групп аминокислот вновь синтезируемого белка с остатками 23S рРНК.В некоторых случаях такое взаимодействие настолько значимо, что приводит костановке синтеза и появлению альтернативных продуктов экспрессии некоторых генов [199—201]. На сегодня известны две области рибосомного тоннеля,где происходит связывание полипептидной цепи с остановкой трансляции. Первый сайт состоит из остатков 23S рРНК, которые относятся к так называемомувнешнему окружению ПТЦ, второй сайт расположен дальше по ходу тоннеля и организован не только нуклеотидами 23S рРНК, но и аминокислотнымиостатками рибосомных белков L4 и L22 [200]. Эти два регуляторных участкаассоциированны с процессом трансляции, перекрываются с сайтами связывания антибиотиков-макролидов, которые затрудняют выход растущей цепи белка, блокируя тоннель.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
