Конформационная динамика нуклеиновых кислот при взаимодействии с лигандами (1098269), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Этот подход позволяет сохранить относительное взаимное расположение остатков, используя набор попарных ограничений на расстояние между частицами. В основу метода дистанционных ограничений заложена информация по вторичной структуры РНК, изкоторой достаточно однозначно определяется большая часть пространственных ограничений. В первую очередь это касается областей стебля вторичнойструктуры РНК, которые в нативных условиях образуют А-форму двойной спирали. Это также распространяется на участки последовательности, для которыхизвестна третичная структура – для тмРНК это псевдоузлы pK1, pK2, pK3 иpK4. Что касается петель и выпетливаний, то, в случае отсутствия взаимодействий с их участием, это достаточно подвижные элементы третичной структуры, что явно следует из результатов ЯМР-исследований.
В случае моделирования взаимодействия тмРНК с рибосомой их конформация, вероятно, будет определяться взаимным расположением элементов структуры, для которых можно построить дистанционные ограничения, а именно: стебли и псевдоузлы. Важной особенностью метода дистанционных ограничений считается85возможность производить моделирование петель с использованием известныхструктур гомологов, имеющихся в базе данных PDB, и эта функция была нами использована для сохранения геометрии места контакта тмРНК с белкомSmpB. Способ описания молекул с помощью упрощенной (``cores grain'') модели в первую очередь уменьшает необходимое время расчетов, так как длительность моделирования молекулярной механики квадратично зависит от количества атомов в системе. Для моделирования всего нуклеотида мы используем лишь один атом фосфора, что дает выигрыш во времени расчета примерно в1500 раз. Кроме того, подобное упрощение позволяет быстро выявлять ошибкиподхода и оптимизировать алгоритм, при этом число пространственных ограничений уменьшается тоже, как минимум, в 1500 раз.Таким образом, после выбора подхода моделирования необходимо было выбрать описание для рибосомы.
Здесь мы решили тоже упростить описание какнуклеотидов, так и аминокислотных остатков. Так как из экспериментальныхданных следует, что при связывании тмРНК конформация рибосомы не изменяется, мы поставили запретит на движение частиц, описывающих рибосому. Каки в случае с тмРНК, остатки РНК и белков в рибосоме описывались одной частицей с зарядом, соответствующим остатку, а для моделирования примернойформы поверхности использовали модифицированные параметры потенциалаЛенарда-Джонса (нуклеотид: =16Å, =5.000 кДж/моль; аминокислота: =8Å,=1.000 кДж/моль), эти параметры примерно описывают средний радиус нуклеотида и аминокислоты.863.1.2Моделирование конформаций тмРНК в комплексах срибосомойВ экспериментальной части работы, которая выполнена Бугаевой Е.Ю иколлегами были выделены комплексы рибосомы с тмРНК.
В работе использован набор тмРНК, которые имели такие различия в первичной структуре, которые позволяли выделять комплексы тмРНК-рибосома, соответствующие разным этапам трансляции открытой рамки считывания тмРНК. Данные, суммирующие описание как вторичной структуры тмРНК, модификаций тмРНК, таки результаты химической модификации тмРНК в комплексах с рибосомой, приведены на Рисунке 3.1. Как видно из Рисунка 3.1, вторичная структура тмРНКпредставлена набором пзевдоузлов и протяжённых стеблей с внутренним петлями.
Для стеблей мы создавали дистанционные ограничения на основе известных данных для двухтяжевой РНК. При описании псевдоузлов использованымодели структур индивидуальных псевдоузлов, полученные на основании данных криоэлектронной микроскопии [192] или ЯМР-анализа [176]. Исходя из результатов по химической модификации, можно предполагать, что все стабильные элементы вторичной структуры сохраняются в исследуемых комплексах.)Для структурной интерпретации полученных экспериментальных данныхпо конформации тмРНК в рибосоме на разных этапах трансляции мы провелимоделирование предложенным выше способом.
Для описания структуры рибосомы использованы координаты атомов, полученные на основании тех данных рентгено-структурного анализа (РСА), где указан путь мРНК в рибосоме[193]. Мы предположили, что кодируемая тмРНК открытая рамка считываниядолжна располагаться там же, где находится мРНК. Моделью тмРНК-2 мы назвали такое состояние тмРНК когда: стоп-кодон находится в А-сайте рибосо87Рисунок 3.1: Описание защит остатков тмРНК в комплексах с рибосомой.Вторичная структура тмРНК построена по даннымrnp.uthct.edu/rnp/tmRDB/tmRDB.html. Псевдоузел pk3 (нуклеотидыU212-A239) заменен на аптамер к стрептавидину.
Общие эффекты отсвязывания с рибосомой для всех комплексов отмечены зелёным кругом(защита) и красным кругом (экспонирование). Синим кругом отмеченыостатки, на которые образование комплекса не влияло. Чёрными кругамиотмечены остатки, склонные к деградации. Нуклеотиды G324 и G325,доступность которых изменяется в комплексах, показаны слева. ОбластьА79-С137 детально представлена внизу рисунка.мы, а предыдущий кодон вместе с тРНК занимает Р-сайт.
В этом случае частьтмРНК должна находится в Е-сайте рибосомы и при этом сохранять структуру,подобную акцепторному стеблю тРНК. Положение стебля L1 заимствовано изработы Harms и коллег [194]. В ходе оптимизации геометрии было принято, чтотолько тРНК- и мРНК-подобные части тмРНК неподвижны в пространстве, а88все остальные области располагаются в пространстве произвольно. В стартовой структуре мы расположили остатки тмРНК по кругу, концы которого замыкались на неподвижных элементах. Формирование известных структурныхэлементов вторичной структуры происходило в ходе оптимизации геометриипод действием дистанционных ограничений (Рисунок 3.2).Рисунок 3.2: Этапы сборки структурных элементов тмРНК вокруг 70Sрибосомы.
Для лучшего восприятия 50S субчастица скрыта от наблюдателя.Тёмно-бирюзовым цветом отмечены нуклеотиды моделируемой тмРНК,оранжевым – рибосомной РНК, зелёным – аминокислотные остатки белков.Полученная в результате моделирования структура тмРНК-2 внутри рибосомы согласуется с данными по химической модификации, полученными какБугаевой Е.Ю.
с коллегами, так и другими авторами (Рисунок 3.3). Белок SmpBзанимает свое положение на тРНК-подобной части тмРНК (TLD) – как это показано Гутманом и др. на основании данных РСА [177]. Область TLD тмРНКнаходится в Е-сайте рибосомы. Защищенные остатки A79–A86 расположенырядом со входом в мРНК-связывающий сайт. Псевдоузел рК1 расположен рядомс Е-сайтом в месте высвобождения тРНК. Оказалось, что между рибосомнымисубчастицами, со стороны стебля белка L1, недостаточно места для одновременного размещения TLD вместе с белком SmpB и псевдоузлом рК1. Стебли 2a,2b и 2c поддерживают расположение домена TLD в Е-сайте рибосомы.
Стебель89pK2h5pK1pK3MLDpK4TLDL7/L12Рисунок 3.3: Модель структуры тмРНК-2 в комплексе с рибосомой (видсверху). 30S субчастица окрашена синим, 50S субчастица – зелёным. тмРНКобозначена чёрной линией, которая отражает ход сахарофосфатного остова.Белок SmpB показан розовыми сферами. Нуклеотиды тмРНК, которыезащищены рибосомой от химической модификации, отмечены зелёнымисферами. Остатки, доступность которых увеличивается при образованиикомплекса, показаны красными сферами. Структурные элементы тмРНКподписаны текстом.2d образует связку между псевдоузлом рК1 и аркой, которая опоясывает областьголовы 30S субчастицы, и располагается на плече. Арка образована псевдоузлами рК4, рК2 и рК3. Стебель 5 расположен рядом со входом в тоннель длямРНК и может легко расплетаться при продолжении движения рибосомы пооткрытой рамке считывания мРНК-подобной части тмРНК.
При расплетаниистебля 5 образующегося избытка длины тмРНК достаточно для того, чтобы арка не смещалась со своей позиции на плече 30S субчастицы рибосомы. Кодон90``возобновления'' находится в Р-сайте рибосомы и второй кодон в рамке считывания в А-сайте. Из полученной модели видно, что все остатки одноцепочечных участков тмРНК взаимодействуют с рибосомой и расположение остатковс увеличенной доступностью для химической атаки соответствует возможнымнарушением цепи РНК.h5pK2pK1h2aTLDpK32bpK42cL7/L12Рисунок 3.4: Модель структуры тмРНК-4 в комплексе с рибосомой (видсверху). 30S субчастица окрашена синим, 50S субчастица – зелёным. тмРНКпоказана чёрной линией, которая отражает ход остова. Белок SmpB показанрозовыми сферами.
Нуклеотиды тмРНК, которые защищены рибосомой отхимической модификации, помечены зелёными сферами. Остатки,доступность которых увеличивается при образовании комплекса, показаныкрасными сферами. Структурные элементы тмРНК подписаны текстом.Таким же способом нами получена модель комплекса тмРНК-4 с рибосомой(Рисунок 3.4). Как и в случае модели тмРНК-2, можно говорить о полном соответствии полученной модели с данными химической модификации и криоэлет91кронной микроскопии. На этом этапе транс-трансляции область TLD тмРНКвместе с белком SmpB перемещается, покидает зону трансляции и располагается на ``платформе'' 30S субчастцы. Этот домен тмРНК не зафиксирован наповерхности рибосомы и может занимать практически любую позицию, не пересекаясь с деацилированной тРНК, которая покидает рибосому через Е-сайт.Стебли 2a, 2b и 2с, с одной стороны, соединяют TLD и псевдоузел рК4, который является частью арки, а с другой стороны, петля А79–А86 поддерживаетсястеблем 2d.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
