Конформационная динамика нуклеиновых кислот при взаимодействии с лигандами (1098269), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Макролиды – это члены большого семейства природныхи синтетических антибиотиков, которые действуют на рибосому. Они содержатмакролактонное кольцо, состоящее из 14, 15 или 16 атомов, к кольцу присоединен один или более остатков природных сахаров [202]. Как только появились99данные РСА по структуре рибосомы, тут же стали пристально изучать комплексы рибосомы с макролидами [203; 204]. В результате этих исследований получена масса информации по взаимодействиям между макролидами с рибосомой.В частности показано, что остатки сахара в макролиде располагаются вдольтоннеля, в то время как лактонное кольцо контактирует с большим участкомтоннеля, практически полностью занимая его полость в [205].
Недавно показано, что некоторые нуклеотиды ингибируют рибосому при синтезе пептида сопределенной последовательностью [206]. Понимание этого сложного явления– как антибиотик взаимодействует не только с рибосомой, но и с продуктомтрансляции – пока находится на самом начальном этапе. Решение этой задачи даст начало новому направлению антибиотикотерапии – разработке классавысокоспецифичных ингибиторов трансляции, которые будут подавлять синтезтолько полипептида, содержащего последовательность, характерную исключительно для белка-мишени определенного патогена.Ранее под руководством академика РАН А.А.
Богданова был синтезированряд пептидных производных тилозина [207—209]. Идея их синтеза заключается в том, чтобы с помощью пептидной части воспроизвести растущую цепь, амакролидную использовать как ``якорь'' для позиционирования пептида в рибосомном тоннеле. Такие конъюгаты оказались удобным инструментом для исследования регуляторного участка рибосомного тоннеля [209]. Недавно синтезирован ряд таких производных тилозина, в которых остаток триптофана находится на разном расстоянии от макролидного кольца.
Здесь триптофан выбраннеслучайно – предполагается, что именно остатки триптофана играют ключевую роль в функционировании пептидов TnaC и SecM как ингибиторов трансляции, связывающихся в рибосомном тоннеле.1003.2.2Подход к полноатомному моделированию молекулярной динамики рибосомного тоннеляКак упоминалось выше, полноразмерное моделирование молекулярной динамики рибосомы пока остается очень затратным подходом.
Поставив передсобой конкретную задачу – на атомарном уровне получить информацию по взаимодействиям рибосомного тоннеля с антибиотиками, мы для ее решения выбрали такой метод моделирования молекулярной динамики, который позволяет наблюдать за эволюцией системы во времени. В связи с тем, что начальноеположение всех частей антибиотика не было определено, сначала необходимопривести систему в состояние структурного равновесия и только потом проводить анализ. По предварительным результатам стало понятно, что для достижения равновесия может понадобиться длительное время наблюдения, что непозволит при моделировании МД учесть все атомы рибосомы и растворителя(≈ 106 штук атомов).Ранее в литературе описан подход [210; 211], суть которого состояла в следующем.
Вокруг интересующего ``объекта'' создавали сферическое окружениеиз остатков компонентов рибосомы. Атомы, которые находятся на краю сферы, подвергали позиционным ограничениям, т.е. их движение было запрещено. После этого сферическая система ``помещалась'' в тригональную ячейкуи ``заполнялась'' водой. В этой системе объем рибосомы, заполненный зарядами, замещён на гораздо менее значимую с точки зрения электростатическихвзаимодействий воду. Надо признать, что такой подход не только далек от реальности, но и не оптимален.Мы предложили строить не сферическое окружение, а кубическое ячейкекубической формы, что позволяет более удачно воспроизводить электростати101ческие свойства окружения, характерные для рибосомы. Следует принять вовнимание, что в трансляции белка часто задействованы не отдельные рибосомы, а полисомы, и наш подход наиболее удачно описывает окружение, свойственное полисомам, где вероятно высока плотность отрицательного заряда изостова РНК и относительно не много воды.
Немаловажно и расположение катионов, нейтрализующих заряд РНК. Известно, что при сборке рибосомы изструктурных компонентов требуются ионы магния. Однако того числа ионовмагния, которое обнаружили при разрешении структуры рибосомы методомРСА [212], явно недостаточно для нейтрализации отрицательного заряда РНК.Известно, что есть определённая геометрия расположения фосфатных группмежду двумя близлежащими нуклеотидами НК – когда образуется так называемый ``магниевый мостик''. Нами разработан инструмент, который позволяетрасполагать катионы магния для образования таких мостиков в любой заданной системе, содержащей остатки НК.
После насыщения системы катионамимагния оставшийся избыток отрицательного заряда нейтрализовали катионаминатрия.Теперь можно было приступать непосредственно к моделированию. Дляэтой цели мы выбрали структуру рибосомы E. coli, которая получена методомРСА c разрешением 3.1Å (PDBID: 3OFR)[212]. Учитывая, что в составе рРНКпрокариотических рибосом есть модифицированные основания, мы дополнили исследуемую структуру информацией по модификации оснований 23S рРНК[213].
Позиции новых атомов оптимизированы методом наискорейшего спуска,который позволяет удалить выскоэнергетичные (слабые) контакты, не затрагивая геометрию системы. Местоположение тилозина, как и его производных, врибосоме E. coli неизвестно, поэтому его определяли по суперпозиции большой субчастицы рибосом E. coli и H. marismortui (PDBID: 1K9M, разрешение1023Å) [205], а все производные тилозина располагали по аналогии.
Следует отметить, что при суперпозиции субчастиц с особой тщательностью рассмотреныконсервативные остатки A2100, A2101, G2102, A2103 и A2538. Полученныеструктуры ориентировали так, чтобы рибосомный тоннель был направлен параллельно оси Х. Все остатки рибосомного тоннеля, хотя бы один атом которыхвходил в кубическую ячейку, содержащую тилозин, были экстрагированы. Длина грани ячейки составила 70 Å. Возможные пустоты в структурах заполнялисьводой, описываемой моделью tip4p, а остатки биополимеров – силовым полемparm99sb [214].
Таким образом, подготовленные системы подвергали стандартным шагам подготовки к моделированию МД. Так, на остатки, которые находились на расстоянии меньше 1Å, накладывались позиционные ограничения. Время наблюдения за каждой системой составляло 500 нс. Конфигурации системысохранялись в файл каждые 60 пс – каждая такая конфигурация в последствиибудет называться кадром и кадром траектории.3.2.3Взаимодействиепептидныхпроизводных5-О-микаминозилтилонолида с рибосомным тоннелемМы уже говорили о том, что моделирование МД использовали для описаниявзаимодействия рибосомного тоннеля с некоторыми макролидами и растущейполипептидной цепью [210; 211]. По отношению макролидам тилозинового семейства этот подход ранее не применялся.
Выше мы аргументировали выборосновных ограничений, которых придерживались при построении модели: экстрагированное из большой субчастицы рибосомы кубическое окружение рибосомного тоннеля, сильно затрудненное движение остатков, атомы которых на-103ходятся на краю выборки, и неограниченная свобода движения для остальнойчасти системы.Для подтверждения релевантности выбранной стратегии мы сначала исследовали динамику комплекса ``тилозин–50S субчастица H. Marismortui'', структура которого известна (PDBID: 1k9m).
Среди множества доступных параметров, описывающих динамику системы, мы выбрали среднеквадратичное смещение (MSD) лактонного кольца относительно стартового (экспериментального) положения после суперпозиции системы относительно рибосомной части.Этот параметр отличается высокой чувствительностью. Согласно выбранномуописанию окружения тоннеля, ожидается, что в ходе моделирования рибосомная часть не совершает ни поступательных, ни вращательных движений. Таким образом, именно смещение ключевого фрагмента макролида – лактонногокольца – будет индикатором нестабильности комплекса. Комплекс тилозина срибосомой стабилизирован одной ковалентной связью, образованной боковойгруппой A2062 23S рРНК и альдегидной группой лактонного кольца.
В полученных траекториях моделирования МД для тилозина не обнаружено значимыхсдвигов в течение всего временного интервала наблюдения а системой (250 нс).Так что показана применимость используемого подхода для моделирования вмикросекундном диапазоне.Полученные данные по изменению MSD для всех изучаемых систем приведены на Рисунке 3.8. Значения MSD для тилозина и Boc-Gly-OMT выходятна равновесные на уровне 0.01 нм2 , что соответствует смещению атомов всегона 1Å.
Это значение меньше РСА-разрешения структуры рибосомы, что позволяет говорить о высоком качестве построенной модели. Значения MSD дляBoc--аминобутурил-ОМТ и ОМТ выше, и соответствуют 0.03 нм2 и 0.06 нм2 .Смещение тилозина меньше, чем его производного Boc-Gly-OMT, что обуслов104лено присутствием в молекуле тилозина двух дополнительных остатков сахара,которые образуют водородные связи с компонентами рибосомного тоннеля. Вчастности (Рисунок 3.9) мицинозы образует три очень стабильные водородныесвязи с остатками G748 и А751 23S рРНК рибосомы E.coli. ОМТ, в отличие отего производного, образует всего одну стабильную водородную связь с компонентами тоннеля, что, вероятно, и является основной причиной его относительно высокой подвижности в модели.Смещение, нм20.18 · 10−26 · 10−24 · 10−22 · 10−20050100150200250300350400450Время, нсРисунок 3.8: Среднеквадратичное смещение лактонного кольца тилозина(чёрная линия), ОМТ (серая линия), Boc-Gly-OMT (оранжевая линия) иBoc--аминобутирил-ОМТ (зелёная линия) производных в рибосомномтоннеле 50S субчастицы рибосомы E.
coli.Надо отметить, что значения MSD для Boc-Gly-OMT сравнимы с таковымидля тилозина и значительно ниже, чем у OMT и Boc--аминобутурил-ОМТ. Этонаблюдение указывает на эффективность сети водородных связей, образуемыхзвеном Boc-Gly-. Действительно, нами обнаружено, что карбонильная группаGly образует две водородные связи: одна с аминогруппой Lys90 из белка L22,вторая с нуклеотидом А752 23S рРНК (Рисунок 3.9). Результаты моделированиясогласуются с общеизвестным фактом о способности карбонильного кислородаобразовывать две водородные связи, выступая при этом в качестве акцептора.Для оценки стабильности водородных связей мы рассчитывали относительное105число кадров траектории с рассматриваемой водородной связью. Полученнаядоля в дальнейшем будет указываться в процентах, принято считать, что водородная связь стабильна, если её доля составляет более 30%. Стабильность, рассчитанная для вышеуказанных водородных связей, образуемых карбонильнойгруппой Gly, составила 42% (Lys90) и 58% (A752).АБВГРисунок 3.9: Структуры тилозина (А), ОМТ (Б), Boc-Gly-OMT (В) иBoc--аминобутирил-ОМТ (Г) и их водородные связи с остатками 23S рРНК илизином 90 из белка L22 в рибосомном тоннеле 50S субчастицы рибосомы E.coli.В отличии от Boc-Gly-OMT, Boc--аминобутурил-ОМТ может формироватьтолько одну стабильную водородную связь с А752 (Рисунок 3.9) и не образуетводородную связь с остатком Lys90 из-за высокой подвижности прилежащейBoc--аминобутурил группы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
