Конформационная динамика нуклеиновых кислот при взаимодействии с лигандами (1098269), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Хотя такие расчётыдолжны быть значительно более точными, чем данные из моделирования МД,трудно экстраполировать эти результаты на полные и сольватированые системы нуклеиновых кислот. Для этого необходимо учитывать всю молекулу НК иеё окружение в КМ-расчётах, а это возможно при использовании современныхподходов к гибридному квантово-механическому/молекулярно-механическомумоделированию.79Глава 3Результаты и их обсуждение3.1Структурные аспекты взаимодействия тмРНК с рибосомойОсновной целью данной работы был поиск подходов к пониманию механистических особенностей функционирования нуклеиновых кислот и определения требований к динамике структуры нуклеиновой кислоты при её функционировании.
Наиболее известной и распространённой органеллой клетки, гденуклеиновая кислота играет ключевую роль, является рибосома. Рибосома –это РНК-белковый ансамбль, в структурной организации и функционированиикоторого РНК играют ключевую роль – при этом зачастую в ходе белкового синтеза, выполняемого рибосомой, ассоциированные с ней РНК меняют свою конформацию.
Самым ярким примером подобной РНК считается тмРНК. Предположительно, эта РНК не только изменяет взаимное расположение своих доменов в ходе выполнения предписанной ей функции, но вообще теряет некоторыеэлементы вторичной структуры. Рибосома – это гигантский рибозим [172], который способен функционально взаимодействовать с широким кругом соедине80ний – от низкомолекулярных антибиотиков до крупных биополимеров (мРНК,тРНК, белковые факторы и т.д.).
Относительно недавно открыт механизм транстрансляции. Это сложный, хорошо организованный процесс, который переключает синтез полипептидной цепи с мРНК на специальный участок (MLD - доментмРНК сходный с мРНК) специализированной транспортно информационнойРНК (тмРНК) [173; 174]. Бактериальные клетки используют транс-трансляциюдля возобновления активности рибосом после ареста, который происходит притрансляции с повреждённой мРНК, направляя повреждённую мРНК и продуктеё трансляции в системы деградации [175]. Во время своего функционированиятмРНК взаимодействует с несколькими белками и рибосомой.Следует сказать, что на момент начала запланированной работы структурные данные по этим комплексам были представлены только структурой псевдоузлов, входящих в тмРНК [176], и структурой комплекса белка SmpB с фрагментом тРНК-подобной части тмРНК [177].
К тому моменту имелись лишь предварительные сведения о строении инициаторного комплекса ``тмРНК-SmpB70S рибосома'' [178; 179]. Относительно недавно Мур и Сайер (Moore & Sauer)[180] предложили гипотетический механизм, с помощью которого тмРНК может различать активные рибосомы от неактивных. Однако особенности строения тмРНК в фазах элонгации и терминации не рассматривались ими. Ранее в лаборатории Донцовой О.А. разработан метод для выделения комплексов тмРНК с рибосомой на разных этапах транс-трансляции [181].
Остановка транс-трансляции достигалась расположением сигнала терминации трансляции в соответствующем месте тмРНК и инактивации фактора терминации,или высвобождения, RF2. Используя этот подход, Бугаева и коллеги с помощьюметода химического зондирования пробинга и криоэлектронной спектроскопииисследовали структуру тмРНК. С точки зрения данной работы особенный инте81рес вызывают значимые структурные изменения, которые претерпевает тмРНКв ходе своего функционирования в комплексе с рибосомой.
Используя подходымолекулярного моделирования и накопленные экспериментальные данные, мыразработали метод, который позволил представить расположение и приблизительную структурную организацию тмРНК в комплексе с рибосомой на разныхэтапах транс-трансляции.3.1.1Разработка подхода к моделированию структурной организации комплексов крупных нуклеиновых кислотПри поиске решения поставленной задачи был проведён анализ возможностей современных инструментов для моделирования третичной структурыРНК.
Точная оценка возможностей и ограничений современных подходов необходимая ступень для выбора оптимального подхода к моделированию структуры тмРНК в комплексе с рибосомой. За последние годы разработано несколькоподходов для предсказания третичной структуры РНК. Большинство из них основано на экспериментальных данных, а также на имеющейся информации овторичной структуре РНК.
Нередко используется гипотетическая или предсказанная вторичная структура РНК, что в случае ошибки приводит к совершенно неверному предсказанию третичной структуры этой макромолекулы. Число известных трехмерных структур РНК, организованных в базы данных PDB[182], SCOR и RNABase [183], постоянно растет, что позволяет проверять модели трехмерной структуры РНК и повышать их качество. Используя приёмы гомологичного моделирования, можно использовать известную структурную информацию для соответствующего участка в составе крупной НК неизвестнойструктуры.82На сегодняшний день только один из методов моделирования, iFoldRNA,предполагает автоматизированный процесс предсказания трехмерной структуры РНК [184]; однако серьезное ограничение iFoldRNA – размер молекулы РНКне превышает 150 остатков, а это существенно меньше интересующего нас объекта.Необходимо отметить программный пакет ERNA-3D, который может создавать трехмерное представление структуры РНК исходя из известной вторичной структуры [185].
Эта программа, исходя из спиральных участков вторичной структуры РНК, автоматически создает спиральные участки ее третичнойструктуры в виде A-формы двойной спирали. В первой версии программы одноцепочечные участки моделировались с помощью итерационных поворотовсахарофосфатного остова. В современной версии одноцепочечные участки имотивы моделируются по гомологии с известными структурами высокого разрешения базы SCOR. Если для одноцепочечной последовательности нет гомолога в базе SCOR, то эти нуклеотиды могут быть расставлены в пространствевручную.Сравнительный анализ последовательностей в программе ERNA-3D былиспользован для определения расположения трехмерного остова маленького домена сигнальной молекулы РНК, включающей псевдоузел.
ПрограммаERNA-3D а использована и для моделирования тмРНК Escherichia coli, Bacillusanthracis и Caulobacter crescentus [186]. Полученные модели обладают всеминеобходимыми функционально-структурными свойствами, но не дают представления о расположении тмРНК на рибосоме. MANIP – программа, собирающая известные фрагменты РНК в сложную трехмерную архитектуру [187]. Дляее работы необходима база данных, содержащая трехмерные фрагменты известных структур.
Алгоритм автоматически определяет и показывает возможные83водородные связи между нуклеотидами. Программу MANIP использовали примоделировании структуры РНКазы P [188].Каркас программной системы Nucleic Acid Builder (NAB) описывает нуклеиновые кислоты как иерархическую структуру и может быть использован дляконструирования как двухцепочечных, так и одноцепочечных РНК – вплоть донескольких сотен нуклеотидов [189]. На основе данных по специфическим взаимодействиям и по известным трехмерным структурам можно определить набор пространственных ограничений для любых структурных элементов, например. для псевдоузлов.
Полученные модели могут быть улучшены с помощьювстроенных инструментов оптимизации геометрии молекулы и моделированиямолекулярной динамики.Программа MC-Sym использует символьные вычисления и численные значения для построения трехмерных структур РНК. Основу этой программы составляют структурные данные, которые записаны как набор символов представлений домена.
Численные значения используются для улучшения символьноймодели [190]. С помощью этого подхода изучена специфичность рибосвитчаSAM-I к SAM [191].В общем случае – чтобы привести структурные данные в соответствие с экспериментальными результатами – все модели, полученные с помощью описанных выше программ, требуют дополнительной проверки и оптимизации вручную. Окончательные модели обычно оптимизируют как по геометрии, так ипо молекулярной динамике. Резюмируя краткое рассмотрение известных подходов к моделированию структуры РНК, необходимо отметить, что все ониимеют серьезные ограничения, связанные с размером изучаемых РНК, а также сложностями, возникающими при моделировании комплексов РНК-РНК иРНК-белок.
Первые попытки проводить моделирование комплексов рибосомы84с тмРНК с использованием полноатомного описания всех участников процесса выявили неэффективность доступных вычислительных ресурсов и алгоритмов. Это ограничение было преодолено при использовании сильно упрощённого описания нуклеотида. Вместо описания всех атомов и их возможных попарных взаимодействий мы решили описывать нуклеотид одной частицей. Центрэтой частицы приходится на положение атома фосфора.
Для описания хода сахарофосфатного остова используется гармонический осциллятор с равновесным значением длины связи 5.6Å, а заряд частицы составляет -1. Очевидно,что такой набор параметров не описывает ни водородные связи, ни стэкингвзаимодействия. Для восполнения потерянной при упрощении информации мыиспользовали метод дистанционных ограничений.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
