Конформационная динамика нуклеиновых кислот при взаимодействии с лигандами (1098269), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Основной структурныйэлемент аптамера 15-ТВА – это G-квадруплексный стебель, состоящий из двухквартетов. Согласно ЯМР–модели, этот стебель сверху экранирован от молекул воды двумя основаниями TGT-петли, G8 и T9. Снизу стебель экранированТТ-парой Т4–Т13. В случае РСА-структуры из TGT-петли только G8 вовлеченв стэкинг-взаимодействие с верхним квартетом, а два основания Т взаимодействуют с нижним квартетом, при этом не образуя между собой водородных связей. Таким образом, можно выделить три структурных особенности, которыемогут определять квадруплексную структуру аптамера:• Водородные связи между основаниями Т4–Т13• Два основания, G8 и Т9, которые вовлечены в стэкинг-взаимодействия сверхним квартетом• Катион металла между квартетамиЯМР–модель, по нашим расчётам, обладает всеми этими особенностями, вто время как РСА-модель описывает только вовлечение в стэкинг основания Т9и катион в центре квадруплекса.Начнем с исследования самой минимальной двухквартетной структуры – вариант аптамера без петель.
Ранее проводили исследование [322] четырёх квар143СистемаЧетырёх тяжевой квадруплекссостоящий из двух G-квартетов скатионом калия в центре.Четырёх тяжевой квадруплекссостоящий из двух G-квартетовбез катиона в центре*ЯМР модель с заменой катионакалия на катион натрия.ЯМР модель без катиона внутриквадруплексаЯМР модель где основание Т9ориентировано в раствор и необразует стэкинга с верхнимквартетом (TG(-T) ЯМР)РСА модель, где основание Т9образует стэкинг с G-квартетом(ТG(+T) РСА)Исследуемый факторВлияние петель на стабильностьG-стебляРезультатG-стебль был стабилен в течении всех 700наносекунд наблюденияРоль катиона в стабилизацииG-стебля.G-стебель потерял структуру в началенаблюденияВлияние параметров описаниякатиона на поведениестабильной структуры 15-ТВА иеё геометриюВлияние стабилизирующегоиона на структурнуюстабильность 15-ТВА.Не замечено значительной разницы вповедении структуры в комплексе сразными катионами.Способна ли ЯМР модельсохранить структуру если толькоG8 из TGT петли образуетстэкинг с G-квадруплексом?Может ли стекингвзаимодействие одногооснования сделать РСА модельстабильной?Несмотря на высокую амплитудуфлуктуаций, модель сохранилаквадруплексную структуру.
На 72 нскатион натрия из раствора проник в центрквадруплекса через ТТ петли(Рисунки 3.25,3.24 ) и стабилизировалмолекулу до конца наблюдения.Аптамер потерял структуру квадруплекса,все квартеты потеряли геометрию, несмотря на наличие пары Т4-Т13 встартовой структуреМодель проявила гораздо лучшуюстабильность и сохраняла квадруплекснуюструктуру в течении 790 нс, в этот моментоснования Т4 и Т13 образовали стекингвзаимодействие, которое привело кнарушению планарности нижнего квартетаи квдруплексная геометрия была потерянаТаблица 3.1: Исследования влияния различных факторов на структурнуюстабильность 15-ТВА.
* Исходно катиона не было в центральной полостиквадруплекса, но в растворе очевидно были катионы способные проникнутьвнутрь квадруплекса.тетных стеблей, но напрямую экстраполировать эти результаты на двухквартетную структуру нельзя из-за очевидного различия в балансе стабилизирующихсил. В таблице 3.1 суммированы результаты наблюдений по влиянию упомянутых факторов на стабильность структуры 15-ТВА.3.4.3Комплексы аптамера 15-ТВА с тромбиномКомплекс 1:1. РСА- структура комплекса аптмера с тромбином была взятаиз банка PDB (PDB ID: 1hut). Мы полагали, что белок может стабилизироватьименно эту конформацию аптамера – т.е. тромбин узнаёт минорную конформацию 15-ТВА и сдвигает конформационное равновесие в сторону РСА-варианта.144Рисунок 3.25: Путь проникновения катиона натрия в центральную полостьаптамера в системе.
где стартовая структура не связана с катионом. Этоизображение соответствует временному интервалу 60-80 нс. Катион (чёрныеточки), двигается – начало движения в левой части рисунка – вдольсахарофосфатного остова и проникает внутрь через ТТ-петли. Далее катионпроходит нижний квартет и в течение всего времени моделирования занимаетпозицию в центре квадруплекса.
Атомы фосфора в остове отмечены серымисферами.Исследование динамических свойств комплексов тромбина с аптамером в РСАи ЯМР-конформациях проводили с помощью моделирования МД со временемнаблюдения 600 нс в силовом поле parmbc0.В стартовой конфигурации комплекса с РСА-конформацией аптамера тромбин связывается с TGT- петлей, а ТТ-петли экспонированы в растворитель.Аминокислотные остатки тромбина, способные быть донорами при образовании водородной связи, взаимодействуют не только с нуклеотидными остатками TGT-петли, но и с нуклеотидом Т3 из ТТ-петли.
Интересно, что именно этовзаимодействие становится причиной последовательного разрушения структу-145донорN3 (T9)N (Ile79)N (Asn78)NH2 (Arg77A)NH1 (Arg77A)N (Arg77A)NH2 (Arg75)NH2 (Arg75)NH1 (Arg75)NE (Arg75)NE (Arg75)ND1 (Hys71)Начальная модельводородH3 (T9)H (Ile79)H (Asn78)HH22 (Arg77A)HH12 (Arg77A)H (Arg77A)HH22 (Arg75)HH22 (Arg75)HH12 (Arg75)HE (Arg75)HE (Arg75)HD1 (Hys71)акцепторOH (Tyr117)O1P (T9)O1P (T9)O4' (G10)O4' (G10)O3' (G8)N7 (G1)O1P (G8)O1P (G8)N9 (G1)N7 (G1)O2P (G8)донорN3 (T7)N3 (T3)ND2 (Asn78)ND2 (Asn78)N (Asn78)N (Tyr76)NH2 (Arg75)NH1(Arg75)N (Arg75)OG1 (Thr74)N (Thr74)Конечная модельводородH3 (T7)H3 (T3)HD22(Asn78)HD22 (Asn78)H (Asn78)H (Tyr76)HH22 (Arg75)HH12 (Arg75)H (Arg75)HG1 (Thr74)H (Thr74)акцепторOH (Tyr117)OG (Ser72)O3' (T7)O2P (G8)O2P (G8)O6 (G8)O1P (G8)O1P (G8)O4 (T3)O3' (G1)O4 (T3)Таблица 3.2: Карта водородных связей в комплексе тромбина с РСАконформацией аптамераa .
а Водородные связи которые сохранились в ходемоделирования МД отмечены жирным, вновь образованные отмеченынаклонным шрифтом.донорN3 (T12)N3 (T12)OG (Ser153)OH (Tyr117)N (Asn78)NE (Arg77A)N (Tyr76)NH2 (Arg75)NH1 (Arg75)NE (Arg75)Начальная модельводородH3 (T12)H3 (T12)HG (Ser153)HH (Tyr117)H (Asn78)HE (Arg77A)H (Tyr76)HH22 (Arg75)HH12 (Arg75)HE (Arg75)акцепторOE2 (Glu77)O (Glu77)O4 (T7)O1P (T13)O (T13)O1P (G14)O4' (T4)O (T4)O4 (T13)O (T4)донорND2 (Asn 78)NH2 (Arg 77A)NH2 (Arg 77A)NH1 (Arg 77A)NH1 (Arg 77A)NH1 (Arg 77A)N (Tyr 76)NH2 (Arg 75)NH1 (Arg 75)NH1 (Arg 75)Конечная модельводородHD22HH22HH22HH12HH12HH12HHH22HH12HH12акцепторO3' (T13)O1P (G14)O4' (G14)O (T13)O5' (G14)O4' (G14)O4' (T4)O4 (T13)O (T4)O4 (T13)Таблица 3.3: Карта водородных связей в комплексе тромбина с ЯМРконформацией аптамераa .
а Водородные связи которые сохранились в ходемоделирования МД отмечены жирным, вновь образованные отмеченынаклонным шрифтом.ры квадруплекса. Паттерн водородных связей комплекса аптамера с тромбиномсильно изменилась за время моделирования: их осталось только 17% (детальная информация представленав Таблице 3.2). В отличие от РСА-конформациив ЯМР-модели аптамер образует контакты с тромбином через ТТ-петли, а TGTпетля экспонирована в раствор. Как и в случае с моделированием аптамера всвободном состоянии, конечная структура хорошо согласуется со стартовой, заисключением ориентации Т7 (Рисунок 3.26)1460.350.3СКО, нм0.250.20.150.15 · 10−20050100150200250300350400450500550600650Время, нсРисунок 3.26: Динамическое поведение аптамера в ЯМР-конформации вкомплексе с тромбином в соотношении 1 : 1.
Изображения аптамерасоответствуют выбранным моментам на графике СКО. Стартоваяконформация аптамера взята из оригинального PDB-файла и использована какструктура сравнения при расчёте полноатомного СКО. Изменение значенияСКО в районе 400 нс связано с перестройкой TGT-петли: остаток Т7 вовлеченв стэкинг с верхним G-квартетом.В отличие от РСА в ЯМР-модели сохраняется 30% исходных водородныхсвязей с тромбином. а изменение структуры аптамера было незначительным.Интересна роль основания Т3, который не представлен в Таблице 3.3. Этот нуклеотид взаимодействует с тромбином через стэкинг с Tyr76. Позже, в 2012 году,методом РСА это взаимодействие подтверждено [323].
Необходимо отметить,что большинство водородных связей, образуемых Arg77 с аптамером, такжеподтверждены данными последнего РСА. Так, Asn78 находится на расстоянии 4Åот атома 3'-О нуклеотида Т13 и потенциально здесь возможно формирование водородной связи – что и было показано нами при моделировании.Таким образом, в ходе моделирования МД комплекса тромбин–15-ТВА намиобнаружены ранее не установленные водородные связи, часть которых позднее147подтверждена методом РСА. Из таблицы водородных связей видно, что остаток Arg77 способен образовывать больше водородных связей, чем Arg75 – ноне единовременно. Именно возможность ``переключения'' водородных связейможет приводить к эффективному связыванию аптамера белком.
Для макромолекулярного комплекса достаточно выгодно ``переключение'' водородных связей за счет использования энергии теплового движения атомов биополимеров.Комплекс 1:2.При моделировании МД комплекса 15-ТВА с тромбином в соотношении 1 :2 выявлены незначительные изменения структуры аптамера, причем и в случаеРСА, и ЯМР. Для ЯМР-модели изменения структуры были меньше, чем в РСА.Если мы назовём тромбин из одной кристаллографической ячейки 'А', а вторую молекулу 'B', то в ЯМР–модели, то ТТ-петли аптамера взаимодействуютс экзосайтом 1 белка 'А', а петля TGT – с экзосайтом 2 белка 'В'. Эти взаимодействия не изменяются в течение 600-нс моделирования МД.
Нуклеотид Т7аптамера, который экспонирован в раствор в комплексе 1 : 1, в комплексе 1 :2 взаимодействует с молекулой тромбина 'В'. а G8 и T9 эффективно экранируют верхний квартет аптамера от положительно заряженных аминокислот идоноров водородной связи экзосайта 2 белка 'В'.В случае РСА-модели взаимодействие аптамера с белком инвертировано,т.е. TGT-петля взаимодействует с экзосайтом 1 молекулы 'А', а ТТ-петли с экзосайтом 2 молекулы 'В'. При моделировании МД, практически с самого началатраектории, наблюдалось значимое нарушение планарности квартетов, но этоне привело к потере структуры квадруплекса. Множественные контакты ТТпетель с остатками белка в экзосайте 2 молекулы 'В' стабилизируют эту часть148аптамера, предотвращая деструктуризацию аптамера в рассматриваемом намидиапазоне времён.Рисунок 3.27: Структура комплекса тромбин-аптамер (2 : 1) как результатмоделирования МД (аптамер в РСА-конформации).3.4.4Структурная динамика G-стебля.
Углы закрутки спирали отражаютструктурное напряжениеМы выбрали угол закрутки двух прилежащих G-квартетов как ключевой параметр описания самого G-стебля. Этот параметр представлен углом междудвумя векторами, которые начинаются и заканчиваются в месте локализацииатома С1' прилежащих остатков гуанина. Схема построения векторов приведена на Рисунке 3.28.
Мы сравнивали значения угла закрутки, его флуктуации входе моделирования динамики 15-ТВА и комплексов тромбин–15-ТВА, а также в беспетлевом двухквартетном квадруплексе. Мы считаем, что беспетлеваяструктура не имеет напряжений, вызываемых петлями, и отражает оптимальное значение угла закрутки квартетов.В ходе моделирования МД выявлены существенные различия в значенииугла закрутки для аптамера в составе рассматриваемых структур, а также при149Рисунок 3.28: Схема определения угла закрутки квадруплекса.сравнении разных структур – что отражает гибкость квадруплекса в планарных движениях (Рисунок 3.29).
Также обнаружена разница между углами, относящимся к разным бороздкам квадруплекса. Используя как объект сравненияструктуру без петель, мы оценили вклад петель и влияние белка на значения угла закрутки квадруплекса аптамера.Заметим, что диапазон значений углов закрутки, который можно найтив опубликованной ЯМР-структуре (горизонтальные синие линии на Рисунке 3.29), значимо отличается от значений моделирования МД свободного аптамера (чёрные линии на Рисунке 3.29). Этот факт, вероятно, отражает неточности в параметрах силового поля, которые сдвигают значения угла закруткиотносительно экспериментальных значений – как это известно для дуплексных ДНК в В-форме. Тем не менее относительное изменение значений, припереходе от системы к системе, эффективно отражает влияние петель и комплексообразования с белком.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
