Конформационная динамика нуклеиновых кислот при взаимодействии с лигандами (1098269), страница 24
Текст из файла (страница 24)
С другой стороны, диапазон углов закрутки для150302520Угол, ∘Угол, ∘201010A)Б)0150200400600508000200Время, нс400600800Время, нс302520Угол, ∘Угол, ∘201010В)Г)0150200400600508000200400600800Время, нсВремя, нсРисунок 3.29: Временная зависимость для угла закрутки между квартетами.Угол измерялся для разных систем в разных бороздках, что отражено всхематических вставках. Данные подвергнуты сплайн-интерполяции.
Серыелинии – это угол между квартетами в беспетлевой структуре. Черные линии –это ЯМР-конформация 15-ТВА в свободном состоянии. Коричневые линии –это комплекс ЯМР-конформации с тромбином (в соотношении 1 : 1). Двегоризонтальные синие линии ограничивают диапазон значений, которыеможно обнаружить в 12-ти моделях ЯМР-структуры (PDB ID:148d).ЯМР-модели 15-ТВА может быть не точен, так как при оптимизации структуры на основе ЯМР-ограничений моделируется отжиг структуры от 1000∘ Кдо 75∘ К после оптимизации геометрии в наборе программ X-PLOR 3.1. Крометого, ЯМР-структура (Рисунок 3.30) имеет выраженную деформацию плоскостей квартетов (непланарность), что может отражать неточность представленияЯМР-данных.151Проведенное нами моделирование МД дало структуру аптамера с остатками квартетов, расположенными в одной плоскости.
Мы сравним десьтолько изменения значений углов при переходе от беспетлевой структуры к структуреаптамера и к комплексу аптамера с тромбином. В целом, петли влияют на уголзакрутки квадруплекса – и петли 15-ТВА заметно ограничивают гибкость квадруплекса. В результате мы наблюдаем значительное уменьшение угла закруткии уменьшение амплитуды флуктуаций (чёрные и серые линии на Рисунке 3.29).Значения углов закрутки для беспетелевой структуры и ЯМР-модели 15-ТВАпрактически не пересекаются.Полагая что, моделирование МД в диапазоне 100 нс по кинетике Арениусаможет покрывать фазовое пространство молекулы с различием в энергии 7–8Ккал/моль от минимума свободной энергии, можно оценить влияние петель.И это влияние значимо.
Интересно, что образование комплекса с тромбиномуменьшает негативное влияние петель на углы закрутки квадруплекса. Влияниетромбина на углы закрутки в основном распространяется на большие бороздки квадруплекса. Аптамер в комплексе с тромбином характеризуется значениями углов закрутки, более близкими к беспетлевой структуре, чем к структуресвободного аптамера 15-ТВА. В комплексе с аптамером тромбин компенсирует влияние петель на большую бороздку, в то время как подобного влияния намалую бороздку не наблюдается.
ТТ-петли являются единственным структурным элементом, способным влиять на угол закрутки малой бороздки; и именно ТТ-петли претерпевают значительные изменения в ходе моделирования(Рисунок 3.30). Вероятно, что именно это напряжение, создаваемое ТТ-петлями встартовой конформации, и является причиной неустойчивости РСА-модели аптамера, так же как и ЯМР-структуры ТG(-Т), где Т9 удален из стэкинга с верхним квартетом.152Для проверки этого предположения две модифицированные модели были подвергнуты МД-моделированию.
Первая модель – это ЯМР-структура после моделирования МД, где основание нуклеотида Т9 переориентировано изстэкинг взаимодействий с верхним квартетом в сторону растворителя. Втораямодель – это, тоже ЯМР-конформация после моделирования МД, но с переориентированием не только Т9, но и соседнего нуклеотида G8. Таким образом,верхний квартет полностью лишился стэкинг-взаимодействий с TGT-петлей.В обоих структурах ТТ-петли имели ранее уравновешенную в МД конформацию – для минимизации влияния на напряжённость квадруплекса. Обе модифицированные структуры успешно сохраняли структуру квадруплекса в ходемоделирования. Основания, которые были переориентированы, восстановилистэкинг-взаимодействия с верхним квартетом.Рисунок 3.30: Структура аптамера 15-ТВА. Слева изображена ЯМР-структура15-ТВА из банка PDB (PDB ID: 148d), справа – после моделирования МД дляконформации слева. Тимины из ТТ-петель обведены чёрными линиями.3.4.5Структурная аннотация последовательности 15-ТВАТромбин, связывающий аптамер (15-ТВА), – это интригующий пример взаимодействия белка с ДНК, содержащей G-квадруплекс.
В дополнение к зало153женной отбором возможности связываться с тромбином и, следовательно, к высокой вероятности получить ``статус'' лекарственного препарата, 15-ТВА представляет важный объект исследования основных физико-химических свойствG-квадруплексов ДНК. Олигонуклеотид 15-ТВА содержит минимально возможное количество G-квартетов – всего два А беспетлевых квадруплексовс двумя квартетами не регистрировали до этого – и тут встает вопрос:как петли стабилизируют структуру 15-ТВА? Структурная стабильность Gквадруплексов напрямую зависит от присутствия катиона во внутренней полости, однако очевидно, что положение катиона внутри полости непостоянно, так что между аптамером и раствором должен происходить обмен катионами.
Итак, молекула должна существовать какое-то время без катиона, а таккак предположительно место связывания только одно, то формирование стабильной структуры со всего двумя квартетами достаточно удивительно. 15-ТВАсодержит три коротких одноцепочечных петли, которые сохраняют сближенность цепей квадруплекса и одновременно необходимы для связывания с тромбином. Кроме очевидной энтропийной составляющей, определяющей сборкуквадруплекса из одной или четырёх цепей, эти петли могут оказывать прямоедействие на G-квадруплексный стебель, и это действие может быть и стабилизирующим, и дестабилизирующим.
Дестабилизирующий эффект может бытьсвязан с длиной петель: петля может быть слишком короткой для того, чтобыподдерживать оптимальную геометрию квадруплекса. Стабилизирующее действие может лказывать дополнительный стэкинг и экранирование молекул воды, которые способны заменить любую водородную связь внутри биополимерабез потери энтальпии системы.Наряду с общими нетривиальными свойствами, понимание структуры15-ТВА осложнено взаимоисключающими экспериментальными данными. Это154результаты по электронной плотности аптамера в комплексе с тромбином и данные ЯМР по взаимной сближенности некоторых протонов для свободного аптамера в растворе. Основное различие между этими данными – это ориентацияосновной цепи– ее ориентация в одном методе является зеркальным отражением в другом. Кроме этого есть различия в данных по положению и способу координации стабилизирующего катиона.
Marathias и Bolton [266] предположили,что с 15-ТВА связываются два катиона калия, но есть информация [324—326]о том, что с 15-ТВА связывается только один катион. О связывании аптамера стромбином тоже есть масса несогласующихся данных.Моделирование МД относится к достаточно разработанным подходам длявыяснения механизмов взаимодействия одновалентных катионов сНК, включаяG-квадруплексные ДНК. Но надо признать, что есть очевидные ограниченияв применении молекулярной механики для этих целей [311; 312]. Например,простое парное взаимодействие в силовом поле не может описать поляризацию электронного облака, что является ключевым эффектом при координациикатионов.
Из-за этого ограничения, мы решили не исследовать детально разницу между катионами калия и натрия при образовании комплекса с 15-ТВА илиоценивать число катионов, одновременно связанных с аптамером. Надо отметить, что в ходе работы мы не наблюдали одновременного связывания двух иболее катионов с аптамером. В принципе, желательно исследовать взаимодействие 15-ТВА с катионами с использованием гибридного метода молекулярноймеханики/квантовой механики [327; 328].
Эти методы к сожалению весьма вычеслительно затратны и ограничивают время наблюдения в течении десятка пикосекунд.Даже продуманное до мельчайших деталей исследование системы в газовойфазе методами стандартных методов квантовой механики не даст полного пред155ставления о балансе сил в 15-ТВА. Но моделирование МД позволяет оценитьвлияние заряда в центре квадруплекса на его стабильность.Мы сравнили динамику 15-ТВА в тех конформациях, которые соответствуют данным РСА и ЯМР по комплексу с тромбином (т.е. с различным ходом основной цепи), в комплексе с белком и в отсутствие петель. Общее время наблюдения превышало 12 мкс, что для такой небольшой молекулы как 15-ТВАсчитается значимым.Исследование разбили на два этапа.
Сначала были проанализированы двеизвестные струкутры аптамера 15-ТВА, а затем их реализация во всех известных моделях комплекса с тромбином. В результате моделирования МД показано, что в растворе, в свободном состоянии, может быть устойчива только структура аптамера, описываемая ЯМР, а предлагаемая методом РСА, даже при увеличении стэкинг-взаимодействия, теряет структуру квадруплекса.
Установленаосновная причина таких различий – разница во внутримолекулярных взаимодействиях, которые могут либо стабилизировать, либо разрушать структуру Gквадруплекса. Стабилизирующая роль, в основном, играет TGT-петля и катионвнутри квадруплекса. Оценить относительный вклад каждого компонента пока не представляется возможным. ЯМР-модель аптамера оказалась достаточностабильной даже в отсутствие катиона внутри квадруплексного стебля – болеетого, в ходе моделирования показано, что такой аптамер захватывает катион израствора, что полностью стабилизирует его квадруплекс. Так называемая беспетлевая версия 15-ТВА без катиона в общем-то нестабильна, но за время моделирования ее структура сохраняется.Итак, рассмотренные структуры 15-ТВА можно расположить в следующийряд по уменьшению стабильности: ЯМР-модель > беспетлевая модель > РСАмодель.
Из этого следует. что главный эффект на стабилизацию структуры15615-ТВА оказывают три петли (ЯМР-структура). Нами показано, что при искусственном ослаблении структуры 15-ТВА выведением нуклеотида Т9 (TGTпетля) из стэкинга с верхним квартетом, структура сильно дестабилизирутся –даже при наличии катиона в центре квартета. Это указывает, но не доказывает, важную роль стэкинга нуклеотида Т9 с квадруплексом. Нельзя исключитьи вероятность, что искусственное вмешательство в структуру аптамера можетприводить к дестабилизации, не связанной непосредственно со стэкингом. Иэтот фактор в ходе моделирования МД выявить трудно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
