Конформационная динамика нуклеиновых кислот при взаимодействии с лигандами (1098269), страница 30
Текст из файла (страница 30)
Парная функция радиальногораспределения между атомами кислорода О6 и катионом калия (краснаясплошная линия) или бария (чёрная сплошная линия). Позиция катиона бариявнутри ДНК стабильна и расстояние от бария до хелаторов флуктуирует внебольшом диапазоне (от 2.69Å до 2.88Å). Позиция катиона калия менеечёткая, наиболее выраженный пик приходится на расстояние в 2.71Å. Среднеекоординационное число катиона калия равно 5.2.Относительное изменение энергии рассчитывали как:+∆ = − − В рассматриваемом случае это 'комплекс' это квантовая подсистема с заглушками в виде атомов водорода, описанная ранее.
Аптамер это такая же система как и комплекс, но без катиона калия. + это катион калия в ячейку такогоже размера как и системы 'комплекс' и 'аптамер'. Размер ячейки важен так как1910.4500.4Расстояние, нм0.3−1,0000.25−1,5000.20.15−2,0000.15 · 10−20−2,50000.20.40.60.811.21.41.6Время, псРисунок 3.45: Изменение относительных значений энергии комплексовкатионов калия с 15-ТВА во время моделирования МД/КМ. Расстояние междукатионом и геометрическим центром квадруплекса показано сплошнымилиниями, а значения энергии отмечены пунктирными линиямисоответствующего цвета. Граница центрального сайта связывания отмеченапунктирной розовой линией.количество плоских волн описывающих волновую функцию напрямую зависитот размера ячейки.В Таблице 3.7 представлены данные только данные для нижнего и центрального сайтов, положение катиона в верхнем сайте было слишком не стабильнодля того, что бы найти средние значения энергии.
Очевидно, что в ходе МД/КМрасчётов перемещение катиона калия из нижнего в центральный сайт связывания происходит с увеличением выигрыша в энергии взаимодействия. Надо отдельно отметить, что все рассчитанные значения энергий ниже нуля и находятся в диапазоне -330. . .-410 кДж/моль. Таким образом направление изменения192Δ , кДж/моль−5000.35система∆ , кДж/моль ∙ 15 − , нижний сайт−362.3 ± 27.2+ ∙ 15 − , центральный сайт−391.2 ± 21.8+Таблица 3.6: Сведение значения энергии взаимодействия катиона калия снижним и центральным сайтами, рассчитанные в этой работе на основеPW-DFT.энергии рассчитанной таким образом подтверждает связывание в центральномсайте.
С другой стороны значения энергий достаточно велики по отношению кэкспериментальным данным и не могут предоставить реалистичного описанииэнергетики этого процесса. Подобного рода расчёты не учитывают ряд составляющих свободной энергии и очевидно, что система не находится в равновесном состоянии. Для сравнительного изучения известных позиций катионов вструктурах Маратиаса и Болтона (PDBID:1с35,1с38) был применён тот же самый подход. Относительные значения энергий для индивидуальных положенийкатиона внутри структур сильно колеблются.
Большинство значений выше нуля (Таблица 3.7), очевидно, что описанные Болтоном положения катионов неуравновешены для проведения подобных расчётов.Надо отметить, что существует значимая разница между моделированиемМД и МД/КМ в описании комплекса аптмера 15-ТВА с катионом. Основное направление схоже в обоих методах, но методы дают разную динамику процесса:в случае МД/КМ процесс перехода из нижнего и верхнего сайтов в центральный сайт связывания происходит в течении двух пикосекунд, в то время как,при классическом моделировании этот процесс занимает наносекунды. Разница возникает из сути методов: классическое моделирование не позволяет воспроизводить форму и поляризацию электронных облаков, и учитывает толькодостаточно далёкие электростатические взаимодействия катиона с аптамером.Простые потенциалы Ленорда-Джонса при описании Ван-дер-Ваальсовых вза193PDBIDIDНижний сайт связывания 101102103104105106107108109110Верхний сайт связывания 2012022032042052062072082092101c35∆, кДж/моль689.9457.31245.2769.4911.3469.0368.2327.6542.7883.7354.4350.6603.3233.5780.7532.21071.11302.1915.9236.01c38∆, кДж/моль100.094.6417.6632.298.3149.8-158.6-165.7156.1174.172.8115052.9-176.6570.7-181.2635.5110.5141692.810.0107293.7Таблица 3.7: Энергии взаимодействия аптмер : катион калия в комплексе наоснове ЯМР данных с использованием PW-DFT подхода.194имодействий также не оптимальны, как уже не раз упоминалось ранее.
МД/КМпотенциально может давать достаточно точное описание динамики, однако мыдолжны подчеркнуть, что полученные нами результаты могут существенно зависеть от приближений сделанных при моделировании квантовой системы, такие как: не полная релаксация системы и очень короткое время наблюдения.Дальнейшие исследования несомненно должны прояснить разницу между подходами и привести к полной сходимости подходов. Тем не менее предварительные МД/КМ расчёты, по крайне мере, примерно показывают различие классического описания от аккуратного описания всей электронной системы.3.5.4Изотермическая калориметрияДля прояснения комплексообразования аптамера 15-ТВА и катиона калия, термодинамические параметры взаимодействия катионов калия и барияс 15-ТВА были изучены методом изотермической калориметрии. Микрокалориметрический подход позволяет полностью характеризовать взаимодействиесубъектов в растворе.
На Рисунке 3.46 приведены кривые титрования катионами калия и бария раствора 15-ТВА в буферном растворе. Очевидно, что барий имеет более высокую аффиность к аптамеру (1.1х105 М-1 против 5.0х103М-1 ) и практически такую же энтальпию связывания (-9.7 кКал/моль против-8.2 кКал/моль) чем катион калия к аптамеру. Применение подгонки по модели 'один набор сайтов' показало, стехиометрия связывания обоих катионов саптамером 15-ТВА близка к 1:1. Исследование конкуренции катионов калия ибария показало, что калий не способен связываться с аптамером если с ним ужесвязан катион бария (чёрная кривая на Рисунке 3.46).195∆, ккал/моль∆ , мккал/сВремя, секСоотношение + / Рисунок 3.46: Кривые изотермического титрования связывания аптамера15-ТВА с катионами калия и бария.
А) Титрование аптамера катионами калияпосле образования комплекса с катионами бария (конкуренция), связывание ненаблюдалось. В) связывание 15-ТВА с катионами калия. С) связываниеаптамера с катионами барияРезультаты нашего моделирования, что основание остатка G8 влияет на эффективное блокирование катионов внутри центрального сайта и участвует впроникновении катиона во внутрь полости квадруплекса. Таким образом замена G8 меньшим по размеру основанием, например пиримидинового ряда, можетоблегчить обмен катионами между аптамером и раствором.
Для проверки это196аптамер125 мМ 15-TBA125 мМ 15-TBA125 мМ 15-TCT250 мМ 15-TCT250 мМ 15-TCTкатион750 мМ KCl750 мМ BaCl2750 мМ KCl833 мМ KCl833 мМ BaCl2Кa , M-11.6x10411x104Не обнаружено0.07x1042.1x104стехиометрия1:11:111:2Таблица 3.8: Термодинамические параметры связывания аптамера 15-ТВА сионами aaБуфер: 140 мМ LiCl, 20 мМ Tris-HCl, pH=6.8го предположения было исследовано взаимодействие мутантного 15-ТВА, гдеG8 был заменён на цитозин (15-ТСТ), с катионами. Результаты изотермическойкалориметрии всех исследованных систем приведены в Таблице 3.8. Олигонуклеотид 15-ТСТ связывается с катионами калия гораздо хуже, чем исходный аптамер 15-ТВА, и сохраняет уровень связывания с катионами бария.3.5.5Заключение об связывание катионов с аптамером15-ТВАДинамика структуры и стабильность гуаниновых квадруплексов плотносвязаны со связывание катионов внутри квадруплексного стебля и иногда сосвязыванием катиона с полостями создаваемыми одно цепочечными фрагментами молекулы, такими как петли.
Несмотря на ограничения [133], моделирование молекулярной динамики может предоставить интересную картину взаимодействия катиона с G-квадруплексной ДНК и дополнить экспериментальныеданные атомистическими деталями процесса.Ранее мы показали, что правильно собранная квадруплексная структура, аименно аптамер к тромбину 15-ТВА, в водном растворе может сохранять структуру достаточно долго для того, что бы захватить случайный катион из раствора[368].
Однако в той части работы мы не наблюдали образования комплексов со197стехиометрией 1:2 между аптамером и катионом о которой ранее сообщали Маратиас и Болтон [349]. Более того, положение катиона внутри квадруплексного участка ДНК отличалось от того, о котором сообщалось ранее в литературе[350; 369], где предполагалось существование двух сайтов связывания катиона калия в атптамере 15-ТВА.
В соответствии с этими исследованиями, первыйсайт располагался между петлёй TGT и прилежащим к петле квартетом,а второйсайт был расположен между ТТ петель. Об положении катиона в центральномсайте связывания не сообщалось. В нашем исследовании мы исследуем эту систему методами моделирования МД, МД/КМ и изотермической калориметрии.Было рассчитано 30 траекторий молекулярной динамики.
Наше исследованиепринесло несколько интересных наблюдений в картину взаимодействия G-ДНКс катионами.Моделирование МД не обнаружило образование комплекса аптамера с катионом со стехиометрией 1:2.Наши результаты предполагают наличие 3ёх потенциальных сайтов связывания катиона в структуре 15-ТВА. Один из них это известный сайт в центральной полости квадруплекса, в то время как два другие это те, которые обнаружили Маратиас и Болтон в месте контакта квадруплекса и петель.
В моделировании только один центральный сайт оказался стабильным. Два других действуют как промежуточные ловушки при захвате катиона из раствора и не могутудержать катион надолго, после чего он перемещается во внутреннюю полостьквадруплекса или возвращается в раствор, если центральный сайт уже занятжругим катионом. Мы считаем, что верхний сайт связывания является болееважным, так как при связывании в нижнем сайте образование ТТ пары препят-198ствует легкому прохождению катиона во внутреннюю полость. Наши наблюдения согласуются с известными экспериментальными данными [370; 371].Атомистическое моделирование позволяет увидеть детали проникновениякатионов во внутрь G-ДНКВ нашей работе мы получили уникальную информацию об способах проникновения катиона во внутрь квадруплекса аптамера 15-ТВА. Существует подвое ворот с каждой стороны квадруплекса.
Верхняя пара ворот формируетсяазотистым основанием остатка G8 из TGT петли (это и есть первые ворота вэтой паре) и размером поры образуемой атомами кислорода О6 гуанинов верхнего квартета. Нижняя пара ворот представлена неканонической ТТ парой нанижней стороне молекулы и, как и случае верхних ворот, размером поры междуО6 гуанинов нижнего квартета. Когда квадруплекс не связан с катионом все ворота открыты благодря электростатическому отталкиванию карбонильных атомов кислорода оснований гуанинов. Атом азота N3 из азотистого основанияостатка G8, расположенный над порой в квартете, тоже несёт отрицательныйзаряд, которые сдвигает основание остатка G8 в сторону от этой поры в центреквартета. Благодаря балансу гидрофобного эффекта и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий основание двигается только параллельно плоскости прилежащегоквартета.
Основание остатка Т9 не имеет атомов с выраженным отрицательнымзарядом рядом с центром квартета и его положение и динамика не сильно меняется с от присутствия катиона в центре квадруплекса (Рисунок 3.33).Как только катион связался где либо с аптамером 15-ТВА его путь в центральную полость происходит достаточно быстро. При попадании катиона вцентральный сайт связывания все перечисленные выше ворота стремятся закрыться. Размер поры между атомами кислорода в квартете уменьшается бла199годаря электростатическому притягиванию к катиону. Это движение предотвращает выход катиона обратно в раствор.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
