Конформационная динамика нуклеиновых кислот при взаимодействии с лигандами (1098269), страница 34
Текст из файла (страница 34)
Стоит отметить, что длины траектории даже в 1 мкс,возможно, является недостаточно для того, чтоб проследить кинетически стабильные и термодинамически выгодные конформации аптамера в составе конъюгата с нанотрубкой. Поэтому частично расплетённые конформации, вероятно, будут полностью развёрнуты при более длительном наблюдении. При гидрофобной функционализации легко заметить, что в присутствии катиона Na+в основном наблюдаются стабильные конформации, а контрольные системы стетраметиламмонием подтверждают, что без катиона металла аптамер теряетквадруплексную структуру. При изучении третьего графика по каждой системе2203'-ал3'-ал+сп5'-ал5'-ал+спdT-алНековалентноМало Tween 20Много Tween 20+NaTMANa+TMA448l44848l448Ö8448Ö44484484КовалентноNa+ÖÖ4488TMA8Ö8Ö8Таблица 3.9: Анализ стабильности квадруплексной структуры 15-ТВА вконьюгатах с углеродными нанотрубками. Представлены 5 групп: с однимстабильным квартетом (4), с двумя стабильными квартетами (44), сполностью развёрнутыми квартетами (8), с развёрнутыми квартетами иобёрнутой вокруг нанотрубки ДНК (8l), а также группа с частичноразвёрнутыми квартетами (Ö).также было замечено, что при высокой концентрации Tween 20, довольно быстро образуется монослой на поверхности нанотрубки, не позволяя ей взаимодействовать с аптамером напрямую.
Можно заключить, что расплетание аптамерапроисходит как при воздействии нанотрубки, так и при экранировании её монослоем Tween 20. В системах с ковалентной функционализацией наличие Na+недостаточно для поддержания стабильного G-квадруплекса и аптамер разворачивается во всех системах, за исключением двух случаев. Во всех системахс Na+ аптамер, модифицированный с 3'-конца, показал себя более устойчивымпри воздействии с нанотрубкой.Предполагаемый механизм работы аптосенсора к тромбинуКак было показано, G-квадруплексная конформация может как сохраняться,так и разрушаться, и это зависит от способа модификации аптамера. Так, введение модификации по 5`-концу аптамера приводит к потере структуры квадруплекса при конъюгации с нанотрубкой. Такая же модификация на 3`-концеаптамера не приводит к столь значимым последствиям.221Основываясь на этих результатах, мы в сотрудничестве с группой Бобринецкого И.И.
из национального исследовательского университета ``МИЭТ'' провели сборку тромбинового аптасенсора. Использование карбоксилфункционализированных нанотрубок позволило создать серию сенсоров сидентичными характеристиками. В экспериментах in vitro показано, что сенсоры достаточно чувствительны и специфичны к тромбину. При сравнении сенсоров с разными модификациями (на 5`- и 3`-концах) выявлено, что только модификация по 5`-концу позволяет детектировать тромбин.+Тромбин51.61.4Подложка5'-амино-15ТВА5'-амино-15ТВА3'-амино-15ТВА3'-амино-15ТВАЛинкер+Альбумин4.541.23.5+Буфер30.82.50.620.41.50.20400Δ, кОмΔ, кОм14505005506006507001,500Время, с1,6001,7001,8001,9002,00012,100Время, сРисунок 3.56: Ответ аптосенсоров на последовательное добавление буферногораствора, тромбина и альбумина.На основании как экспериментальных (Рисунок 3.56), так и расчетных данных, можно предложить механизм работы подобных сенсоров.
Проводимостьнанотрубки зависит от того, участвует ли 15-ТВА в многочисленных стэкинг222взаимодействиях с поверхностью нанотрубки. В отсутствие тромбина аптамер15-ТВА не имеет выраженной структуры и распластан на поверхности нанотрубки, но при возможности образовать комплекс с тромбином конформационное равновесие смещается в сторону компактной структуры, которая практически не имеет контактов с нанотрубкой. Именно столь значимое конформационное изменение, вероятнее всего, и приводит к изменению проводимоститрубки. Предполагаемый механизм представлен на Рисунке 3.57.Тромбин15-TBAРисунок 3.57: Изображение механизма работы аптасенсора на основе5`-модифицированного варианта аптамера к тромбину. Красные сферы - этоотрицательно заряженные фосфатные группы.
Зеленым окрашена углероднаянанотрубка. Белым и голубым отмечен тромбин.2233.7Температурная зависимость пути сомоорганизации ДНК шпильки d(GCGCAGC)3.7.1Метод обмена репликами для изучения фазового пространства биополимеровКак мы уже показали, компьютерное моделирование, такое как МД, можетбыть использовано для изучения сложных молекулярно-биологических систем.Для классического моделирования с использованием силовых полей существует два источника ошибок: первый – это неточность при составлении силовогополя, второй –недостаточное сканирование фазового пространства. По отношению к моделированию МД главный фактор ошибок – это недостаточное времянаблюдения. на основании полученных нами результатов можно говорить, чтодля такой небольшой молекулы как 15-ТВА время наблюдения должно находиться в микросекундном диапазоне.
Неудивительно, что исследователи частоиспользуют простые системы для проверки силовых полей и методологий сканирования фазового пространства. Надо отметить, что важен не только размерсистемы, но способность биополимера быстро самоорганизоваться в нативнуюструктуру. Именно такие объекты выбираются для одного из самых сложныхприменений моделированияМД – моделирования процесса самоорганизацииструктуры биополимера линейной конформации.
Такого рода моделированиедолжно быть очень продолжительным, время наблюдения за системой зависитот её природы и может достигать секунд, что в миллион раз больше, чем траектории, описанные в этой работе. Важно, чтобы силовые поля правильно описывали не только конформации, известные из экспериментальных данных, но ите состояния, которые являются нестабильными. Затраты на подобные экспери224менты компенсируются значимостью получаемых результатов: возможно получение детальной информации о кинетике переходных состояний и взаимосвязиэтапов самосборки. Надо признать, что моделирование МД не единственныйпуть получения подобной информации. Моделирование методом Монте-Карлотоже может дать реалистичный путь механизма самосборки, но кинетическаяинформация при этом может быть утеряна. Хотя другие методы предлагают эффективные алгоритсы расчетов, только полоноатомная молекулярная динамика позволяет получать детальную информацию о переходах между конформациями, что и является ключевым моментом в описании процесса самосборки.Традиционные экспериментальные методы ЯМР и РСА идентифицируют доминирующую в растворе или единственную в кристалле конформацию, хотя завыполнение биологической функции может отвечать одна или несколько относительно менее представленных конформаций.
Такие состояния, а также кинетические барьеры между ними являются ключевыми для понимания функционирования молекулы. Именно эти данные мы искали в траекториях моделирования самосборки выбранной ДНК-шпильки.Для решения этой задачи был использован подход, основанный на применении цепей Маркова с дискретным временем [381]. В этом подходе предполагается, что конформационные переходы внутри микросостояний происходятзначительно быстрее, чем между микросостояниями. Поэтому, относящиеся кодному микросостоянию конформации должны быть структурно достаточноблизкими. Вероятно, к одному микросотоянию должно относиться достаточнобольшое число конформаций.Нами проведено исследование по сравнению конформационного ландшафта короткой ДНК-шпильки при разных температурах. Моделирование самосборки шпилечной структуры проводили при 27∘ С и 0∘ С.
Одна из основных225проблем, возникающих при моделировании самосборки НК, равно как и другихбиологических макромолекул, – большоое число локальных минимумов энергии. Существует ряд методов, направленных на решение этой задачи. Так, например, для изучения самосборки биологических макромолекул группа Pande[382] использует большое число коротких траекторий молекулярной динамики.
Данный подход исходит из предположения о том, что самосборка – этоочень редкий, но очень быстрый процесс. Ряд статей этой группы посвященсамосборке НК. Так, в одной из работ [383] обсуждается образование структуры 5'-GGGC[GCAA]GCCU шпильки в неявно заданном растворителе, а в статье citepmid15681648 сравниваются пути самосборки той же шпильки в явно инеявно заданных растворителях. Другим подходом к решению проблемы большого числа локальных минимумов является метод обмена репликами (ReplicaExchange Molecular Dynamics, REMD).
Существует лишь несколько работ, посвященных REMD ДНК [384—387]. Суть этого метода состоит в создании копий, или реплик, системы с их последующим моделированием при различныхтемпературах. В ходе моделирования каждая копия системы совершает случайные блуждания по пространству температур в результате обмена состояниямимежду соседними по температурам репликами через равные промежутки времени. Вероятность обмена между соседними репликами выражается формулой:(︂[︂(︂)︂]︂)︂11 (1 ↔ 2) = 1, −(1 − 2 ) , 1 2где —константа Больцмана, 1 и 2 —температуры, а 1 и 2 —мгновенные потенциальные энергии реплик 1 и 2 соответственно. Иначе говоря, еслидве соседние реплики (реплика 1 с температурой 1 и реплика 2 с температурой2 ) оказались близкими по энергии, то может произойти переход, в результате226которого конформация, содержавшаяся в реплике 1, перейдет в реплику 2 и будет далее моделироваться при температуре 2 , a конформация, содержавшаяся вреплике 2, перейдет в реплику 1 и будет далее моделироваться при температуре1 .На данном шаге попытки обмена совершаются не между всеми возможнымисоседними парами реплик: есть деление на ``четные'' и ``нечетные'' попыткиобмена, осуществляемые по очереди.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
