Конформационная динамика нуклеиновых кислот при взаимодействии с лигандами (1098269), страница 32
Текст из файла (страница 32)
Практически невозможно получить такую205информацию на основе экспериментальных данных, так как это потребовалоэффективной детекции сигнала в микросекундом диапазоне с атомистическимразрешением для ДНК и катионов. Итак, не смотря на очевидные ограничения,длительные моделирования МД в будущем смогут принести важное понимание в картину переходов между как микросостояниями, так и макросостояними, которые можно обнаружить экспериментально, в процессе организации иперестроении структуры квадруплексных ДНК.2063.6Ключевые факторы, влияющие на конформационную динамику 15-ТВА, и их применение3.6.1Динамика 15-ТВА и функциональная активностьВ настоящее время ДНК/РНК-аптамеры рассматриваются как потенциальноперспективный класс лекарственных средств, обладающих высокой специфичностью и идеальными фармакокинетическими свойствами.
Принципиальноеотличие аптамеров от олигонкулеотидов, действие которых основано только напоследовательности, – это формирование функционально стабильной третичной структуры. Именно стабильность структуры, скорее всего, есть тот фактор,улучшая который, мы можем увеличить эффективность действия аптамера.Ранее методами калометрии и кругового дихроизма показано, что температура плавления структуры 15-ТВА близка к температуре человеческого тела[376]. Для повышения эффективности действия аптамера необходимо увеличить его структурную стабильность. При изучении структурно-динамическихсвойств аптамера 15-ТВА нами выявлено возможные пути повышения егоструктурной стабильности.
Самы простой путь подразумевает повышение стабильности квадруплекса путём формирования стабильного комплекса аптамерас катионом. Однако тромбин взаимодействует с ТТ-петлями, подвижность которых связана с динамикой самого квадруплекса. По-видимому, сила связываниякатиона с квадруплексом модулирует эффективность взаимодействия аптамерас тромбином. Этот путь легко проверить путём оценки тромбин-ингибирующейактивности аптамера в присутствии катиона бария.
Нами выявлено, что константа аффинности для комплекса аптамера с барием на порядок выше, чемпри связывании катиона калия, а энтальпии комплексообразования для обоих207катионов сравнимы. Присутствие катиона бария значительно повышает температуру плавления квадруплекса, энергия сольватации катиона бария составляет -1305 кДж/моль, а для катиона калия -302 кДж/моль.
И это согласуется срезультатами моделирования: по сравнению с катионом калия барий практически неподвижен. В экспериментах, проведенных совместно с Е.В. Завьяловой,обнаружено, что в присутствии катиона бария антитромбиновая активность аптамера гораздо ниже, чем в присутствии калия (Рисунок 3.48).Рисунок 3.48: Сравнение ингибирующей активности 15-ТВА в присутствиикатионов калия и бария.Более того, в своей диссертационной работе Завьялова Е.В. утверждает, чтоингибирующая активность аптамера 15-ТВА обратно пропорциональна степени стабилизации структуры катионами.
То есть если можно составить ряд катионов по стабилизирующему влиянию на квадруплекса как: Na+ <K+ <Ba2+ , товлияние этих катионов на ингибирующую активность имеет обратную зависимость: Na+ >K+ >Ba2+ . Отсюда следует, что в ходе взаимодействия с тромбиномквадруплекс или ТТ-петли не должны терять свою подвижность.Для изучения атомистических причин этого явления мы использовали моделирование диссоциации комплекса 15-ТВА с тромбином методом зонтичного208интегрирования (“umbrella sampling"). Предполагается, что диссоциация комплекса тромбин–15-ТВА – это процесс линейного смещения центров масс тромбина и аптамера, тогда координатой реакции будет выступать расстояние между соответствующими центрами масс. В этом моделировании нас интересуетизменение структуры аптамера в ходе реакции диссоциации с белком.
В ходесканирования координат реакции с шагом 0.5Å квадруплексная часть аптамерапретерпевает значительные изменения. В районе приблизительно 35Å для расстояния между центрами масс аптамера и тромбина мы наблюдаем уменьшениечисла водородных связей как между тромбином и аптамером, так и между гауниновыми основаниями квадруплекса (Рисунок 3.49).Количество водородных связей (шт.)252015105028303234363840424446Координата реакции (Å)Рисунок 3.49: Изменение числа водородных связей в ходе моделированиядиссоциации комплекса тромбин–15-ТВА. Над графиками указаны структурыаптамера, соответствующие участкам траектории.
Синими символамиотмечены водородные связи в квадруплексе, зелёными – в комплексе15ТВА-тромбин.Итак, квадруплекс теряет часть внутренних водородных связей при формировании конформации, которая способна связаться с тромбином. Чем силь209нее связан катион внутри квадруплекса, тем меньше вероятность формирования такого переходного состояния. Стабилизация квадруплексной структурыне приводит к повышению ингибирующей активности аптамера.
Необходимосохранять конформационную подвижность аптамера, близкую к подвижности15-ТВА, но при этом уменьшить представленность конформаций аналогичныхполностью денатурированому состоянию.3.6.2Исследование структурного влияния дуплексной частиДНК на G-квадруплексИзвестно, что просоединение предположительно дуплексного участка кконцам молекулы 15-ТВА приводит к повышению активности такой конструкции как ингибитора тромбина [377].
С целью установить трехмерную структурутакого гибридного аптамера (в дальнейшем мы будем называть его 31-TGT) мыпровели ЯМР-исследование. На основе соотнесения пиков спектров двумерныхNOESY, DQF-COSY и HSQC найдено 247 дистанционных ограничений междуатомами 31-TGT. С использованием этих ограничений построена модель структуры (Рисунок 3.50).Как и в случае с 15-ТВА, аптамер 31-TGT содержит квадруплексный фрагмент с идентичным 15-ТВА состоянием ТТ-петель. Однако конформация TGTпетли претерпела существенные изменения (Рисунок 3.50).
Так. G16 (соответствует G8 из 15-ТВА) из TGT-петли образует стэкинг-взаимодействия не с квартетом, а с остатком А8 из дополнительной части. Заметим, что в 31-TGT естьдуплексный участок, но он не вовлечен во взаимодействия с квадруплексом. Таким образом, в аптамере 31-TGT действительно реализован эффект отсутствиястабилизирующего влияния дуплексной части на квадруплекс. К сожалению,210G31C1T30A2G29C3A28T4C27G5C26A8T17G24T15T7G23A8G18G9G14G22G13T21T11T21G19G10A)T15G16G25G6G16T12T12T20Б)В)Рисунок 3.50: Структура олигонуклеотида 31-TGT. A) Вторичная структура31-TGT. Красным отмечена квадруплексная часть, оранжевым – дуплекснаячасть.
Б) Модель третичной структуры 31-TGT по данным ЯМР. В) Модельструктуры квадруплексной части 31-TGT, оранжевым цветом отмеченыG-квартетыаптамер 31-TGT не отличается высокой специфичностью – он связывается и спротромбином, а это сильно ограничивает его терапевтический потенциал.
Дело в том, что концентрация протромбина в крови намного выше концентрациитромбина, а значит и эффективные концентрации будут высокими.3.6.3Разработка терапевтического аптамера к тромбинуМы предприняли попытку разработать аптамер на основе 15-ТВА с дополнительным структурным модулем, увеличивающим аффинность связыванияаптамера с тромбином и при этом избежать неспецифических взаимодействийс другими белками крови. При разработке новой конструкции учитывали, вопервых, найденную корреляцию активности 15-ТВА с подвижностью его ТТпетель, а во-вторых, наблюдение, что при захвате катиона из раствора происходит временная частичная дисбалансировка структуры квадруплекса с изменением подвижности концевых гуанинов 15-ТВА.
При этом 5'-конец 15-ТВА под211вержен заметным структурным перестройкам, а 3'-концевой нуклеотид не проявляет значимой подвижности. Так, введение модификаций на 5`-конец больше влияет на функциональную активность аптамера, чем при модификациях3`-конца. Это напрямую связано с динамикой структуры всей молекулы.Одним из предложенных нами решений было следующее: сделать двухквадруплексный вариант аптамера, т.е.
две последовательности 15-ТВА, соединённые коротким нуклеотидным мостиком. У такой молекулы (в дальнейшем RA-36) на 5'-конце будет квадруплекс, подвижность которого не отличается от 15-ТВА, а квадруплекс на 3'-конце будет более подвижен, так как с его5'-концом связан первый квадруплекс.Сейчас методом кругового дихроизма выявлено наличие квадруплекснойструктуры в растворе RA-36. Данные о тромбин-ингибирующей активностиRА-36 подтверждают его эффективность.
Параметрически RА-36 обладаетсвойствами потенциально пригодного для терапии препарата и в настоящее время находится на стадии формальных доклинических испытаний. Таким образом, моделирование позволяет понять структурные особенности НК и на основе полученных данных проводить рациональный дизайн новых биологическиактивных соединений.3.6.4Разработка аптасенсора к тромбинуПонимание структурной динамики аптамера 15-ТВА мы применили для создания сенсоров, которые можно использовать для определения концентрациитромбина.
Надо признать, что на текущий момент в клинике практически непредставлены методы прямого определения тромбина в крови, хотя эта информация очень важна для понимания статуса гомеостаза пациента.212Сенсор разрабатывали как элетропроводник на основе углеродных нанотрубок. Ранее показано, что одноцепочечная ДНК способна сорбироваться на поверхности углеродных нанотубок [378], образуя сеть стэкинг-взаимодействий.ДНК обладает высокой плотностью отрицательного заряда и это может влиятьна проводящие свойства углеродной нанотрубки. Предполагалось, что аптамерпри взаимодействии с нанотрубкой будет частично денатурировать и сорбироваться на поверхности, а в присутствие тромбина равновесие будет смещатьсяв сторону собранной квадруплексной структуры. Эти переходы будут сопровождаться значимым изменением электростатического окружения нанотрубкии её проводимости.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
