Жидкофазные дисперсные системы как основа микрогетерогенных полимерных матриц для трансдермальной доставки лекарств (1098267), страница 11
Текст из файла (страница 11)
В случае Лк отбирали пробу приемной (примерно2.7 см3), переносили ее в спектрофотометрическую кювету, а после измерениясразу возвращали в акцепторную часть ячейки Франца. В случае белка пробуобъемом 30–50 мкл отбирали с помощью дозатора и в спектрофотометрическойкювете разбавляли приемной средой, после измерений пробу не возвращали вячейку Франца, что учитывали при расчетах.
Значения длины волны (max),соответствующей максимуму поглощения целевого компонента в приемной среде,и молярного коэффициента экстинкции Emax определяли заранее (приложение 1).Значения СК рассчитывали с помощью соотношения:СК = (Аmax/Еmax)Р,(17)где Аmax – оптическая плотность при max, Р – разбавление образца.В случае амлодипина в опытах на коже его концентрацию в приемной средеопределяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).Данные ВЭЖХ получены М.Ю.
Горшковой (Институт нефтехимического синтеза62имени А.В. Топчиева РАН), на их основе нами рассчитывались параметрытрансдермального массопереноса Лк.Количество целевого компонента QК (мкг/см2), выделившееся из тестируемойполимерной матрицы (пленки) и прошедшее через единицу площади поверхностимембраны (или кожи) за время t, рассчитывали следующим образом:QК = CКV/S0,(18)где СК – экспериментально определенная концентрация целевого компонента(мкг/см3) в приемной среде на момент времени t; V – объем приемной среды в см3 иS0 – площадь, через которую идет диффузия, равная площади отверстия ячейкиФранца.
При использовании мембраны с размером пор 50 нм S0 = 0.26 см2.Опыты повторяли 56 раз, вычисляли средние значения QК. Из зависимостейQК(t) определяли скорости диффузионного массопереноса целевого компонентачерез мембрану (или кожу).2.1.13. Определение ферментативной активностиФерментативную активность (ФА) лизоцима определяли по кинетикедеградации стенок бактериальных клеток под действием данного фермента[176178].
В качестве бактериального субстрата использовали порошок клетокMicrococcus Lysodeikticus фирмы Sigma. Суспензию биомассы в фосфатном буфере(рН = 6.86) использовали при условии, что ее оптическая плотность при 450 нм(А450, относительно фосфатного буфера) была не ниже 0.6.При введении лизоцима в суспензию в результате ферментативной реакции,заключающейся в гидролизе полисахаридных стенок бактерий, наблюдаетсяуменьшение оптической плотности. Оптическую плотность суспензии при 450 нм(А450) измеряли через каждые 10 с в течение 2-х мин, далее через каждые 30 с(рис. 16). Максимальную скорость гидролиза V0 = lim(А450/t)t0, котораяявляется мерой ФА, определяли по начальному линейному участку зависимостиА450 от времени (рис. 16). В отсутствие добавок лизоцима оптическая плотностьсуспензии клеток А450 не зависела от времени.При определении ФА использовали двулучевой спектрофотометр Helios ZetaUV-VIS («Thermo Scientific Inc.»), который позволяет автоматически измерятьоптическую плотность во времени при фиксированной длине волны.
В качестве63раствора сравнения применяли растворы идентичного состава без целевогокомпонента.A 4500,80,710,620,530,440,30100200300400t, cРис. 16. Уменьшение во времени оптической плотности А450 суспензиибактериальной культуры Micrococcus Lysodeikticus в фосфатном буфере (рН = 6.86)при различных концентрациях лизоцима: СЛз = 1.06510-8 (1), 2.1310-8 (2), 3.2510-8(3), 5.0910-8 М (4). Исходная концентрация бактериальных клеток 0.120 мг/см3.Важно подчеркнуть, что концентрацию фермента можно определять по егоФА, что требует соблюдения определенных условий. Известно, что кинетикаферментативныхреакцийопределяетсясоотношениемсубстрат/фермент.Полученные зависимости начальных скоростей лизиса V0от начальныхконцентраций фермента и суспензии клеток можно разделить на три основныхтипа [179]:1) при низкой концентрации фермента и высокой концентрации субстратанаблюдаетсялинейнаязависимостьV0отконцентрацииферментаигиперболическая зависимость от концентрации клеток;2) при сопоставимых количествах фермента и субстрата начальная скоростьлизиса не является прямо пропорциональной концентрации фермента;3) при концентрациях лизоцима, превышающих концентрацию субстрата,величина V0 линейно зависит от концентрации бактериальной суспензии и почти независит от концентрации фермента.64Таким образом, только первая концентрационная область, когда концентрациясубстрата является преобладающей и функция V0(СЛз) линейна, подходит дляколичественного определения концентрации лизоцима по ФА.
Для исследованныхнами систем концентрация суспензии субстрата составляла 0.012 масс. %, что в164–786 раз превышает концентрацию фермента. Суспензию бактериальныхклеток в буферном растворе готовили непосредственно перед кинетическимэкспериментом.Линейная калибровочная зависимость V0 = koСЛз (где ko = 36200100 М-1с-1)использовалась для оценки концентрации Лз в приемной среде в ячейке Францапри изучении кинетики выделения фермента из разработанных полимерныхматриц.2.1.14.
Методики получения эмульсий и полимерных матрицЭмульсии В/М и М/В готовили весовым методом из заранее приготовленныхрастворов стабилизирующих НПАВ и полимеров в воде и в соответствующемнеполярном растворителе. Эмульгирование проводили с помощью ультразвуковогодиспергатора УЗДН-А (Россия, частота 22 кГц) в ячейке, охлаждаемой водой.Время диспергирования – 30 с. В некоторых случаях диспергировали приперемешивании на магнитной мешалке, при этом эмульсия находилась вгерметически закрытом пузырьке.Двойные эмульсии М1/В/М2 получали в две стадии. На первой стадии готовилиминиэмульсию М1/В при ультразвуковом диспергировании в присутствиигидрофильных стабилизаторовиингибиторовОС,на второйприменялиосторожное перемешивание миниэмульсии с раствором липофильного полимерногоадгезива (М2).При формировании полимерных матриц из эмульсий в качестве подложкиприменялиприменяетсяполиэтилентерефталат(ПЭТ,маркив трансдермальных пластыряхупотреблениемпленки.ПЭТLoparexвLoparex7300A),которыйкачестве удаляемой7300Aимеетпереднеадгезионную(силиконизированную) и адгезионную стороны.
Гидрофобность двух различныхповерхностей ПЭТ оценивали по значению краевого угла смачивания водой (Н2О).Краевые углы смачивания измеряли с помощью горизонтального микроскопа,65снабженного фотокамерой. Точность измерений составляла 1.
Значения Н2О дляадгезионной и неадгезионной сторон ПЭТ при 20С соответственно составляли 93и 105.Из эмульсий методом полива при использовании ракли, гарантирующейтолщину нанесения (250, 375, 500 или 625 мкм), на силиконизированнойповерхности ПЭТ получали тонкие слои эмульсий (жидкие пленки). Как правило,толщина нанесения составляла 500 или 625 мкм. Сушка пленок осуществляласьпри 4050С в течение 3060 мин в сушильном шкафу Binder (Germany) сгоризонтальным потоком воздуха. Схема получения пленок представлена на рис.17.Рис. 17.
Схема, иллюстрирующая получение полимерной матрицы изэмульсии методом полива.Остаточное содержание органического растворителя (гептана, этилацетата,толуола, циклогексана) определяли с помощью газовой хроматографии (ГХ).АнализпроводилинамодифицированномхроматографеЛХМ-8МДсиспользованием капиллярной колонки длиной 28 м и внутренним диаметром 0.32мм со слоем неподвижной жидкой фазы SE-54 толщиной 3.5 мкм.
Газ-носитель –гелий, давление на входе в колонку составляло 0.9 атм. Использовался дозаторинжектор с делением потока газа-носителя 1:50. Детектор – пламенноионизационный, шкала электрометра (5–20) 10-12 А.. Например, к образцам пленоквесом около 20 мг добавляли 480 мкл бензола (при определении толуола) илиоктана (при определении циклогексана), перемешивали при 50С в течение 20 мин.66Во всех случаях объем пробы составлял 0.5 мкл. Для калибровки использовались0.1 об.
% растворы толуола в бензоле или циклогексана в октане. Концентрациютолуола (или циклогексана) определяли по высотам соответствующих пиков в 57опытах. ГХ анализы выполнены А.А. Королевым (Институт нефтехимическогосинтеза имени А.В. Топчиева РАН). Содержание органического растворителя впленке после сушки во всех случаях не превышало 0.3 масс. %, что отвечаеттребованиям к ТП.Высушенные полимерные матрицы ламинировали базовой пленкой (ScotchPak 9732). Толщины полимерных матриц после сушки определяли с помощьюмикрометра с учетом толщин базовой и удаляемой пленок.
Полученные ТПхранили в запаянных фольгированных пакетиках.2.2.Объекты исследования2.2.1. Липофильные лекарстваОсновные исследования выполнены на примере фелодипина и амлодипина (вформе оснований), являющихся современными лекарствами от гипертонии истенокардии, блокаторами кальциевых каналов [180].Структурные формулы фелодипина (Ф (RS)-3-этил 5-метил 4-(2.3дихлорфенил)-2.6-диметил-1.4-дигидропиридин-3.5-дикарбоксилат) и амлодипина(Ам – (RS)-3-этил 5-метил 2-[(2-аминоэтокси)метил]-4-(2-хлорофенил)-6-метил-1.4дигидропиридин-3.5-дикарбоксилат) приведены в табл. 5.
Оба Лк липофильны,плохо растворимы в воде (особенно Ф), биодоступность при пероральномприменении для Ф и Ам составляет соответственно 20 и 60%. Оба препаратаэлектронейтральны, стабильны в растворе, их растворимость не зависит от рН,молекулярная масса не превышает 500 Да. Перечисленные характеристики делаютФ и Ам хорошими модельными Лк при разработке коллоидно-химических основтрансдермальной доставки. При комнатной температуре оба Лк находятся втвердом агрегатном состоянии. В работе использованы Ф фирмы «PCAS»(Финляндия) и Ам фирмы «Afine Chemicals Limited» со степенью очистки 99 %.Некоторые физические свойства исследованных Лк приведены в табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
