Диссертация (1091617), страница 15

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 15)

Зависимости ответа биосенсора от БПК, содержаниедрожжей 20 мг на 100 мкл геля, толщина биорецепторных элементов от 0,05до 0,2 мм.Полученные зависимости величины ответов биосенсоров от БПКимеют гиперболический вид (рисунки 34,35). Аппроксимация проведена поуравнению Михаэлиса – Ментен, поскольку в стационарном состояниизависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстратачасто подчиняется этому уравнению:Rгде Km -R max [S]0K m  [S]0и Rmax – основные кинетические характеристикиферментативной реакции.Rmax – максимальная скорость ферментативной реакции, при которой всемолекулыферментаучаствуютвкомплекса, достигается при [S]→∞;105образованиифермент-субстратногоКM – константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, прикоторойскоростьферментативноймаксимального значения (R=Rmax/2) иреакциидостигаетполовиныхарактеризует сродство данногофермента к тому или иному субстрату.Параметры рассчитаны в программе Sigma Plotи представлены втаблице 14.Таблица 14.

Коэффициенты уравнения Михаэлиса-МентенПараметрыБиорецепторныйэлемент №1Биорецепторныйэлемент №2Биорецепторныйэлемент №3Биорецепторныйэлемент №4Биорецепторныйэлемент №5Биорецепторныйэлемент №6Биорецепторныйэлемент №7КажущаясяконстантаМихаэлиса, К`m,мг/дм3Максимальнаяскорость, Vmax, мгO2/дм3 минКоэффициенткорреляции, R6±20,48 ± 0,040,98857±20,66 ± 0,040,990130 ± 32,37 ± 0,060,993647 ± 42,02 ± 0,050,996658 ± 32,27 ± 0,040,998242 ± 22,15 ± 0,040,998541± 31,63 ± 0,040,9963В работе рассчитана кажущаяся константа Михаэлиса (К’m), посколькуона зависит от рН среды, присутствия в системе ингибиторов илиактиваторов, наличия многосубстратной и многоферментной (целые клеткидрожжей) системы, а также дополнительных стадий в схеме реакции.106При увеличении содержания дрожжей в биорецепторном элементепроисходит увеличение кажущиеся константы Михаэлиса с 6 до 58 мг/дм3таблица 14).

Сама константа Михаэлиса не зависит от концентрациифермента, при увеличении количества фермента увеличивается скоростьферментативной реакции [101].При увеличении толщины исследуемыхбиорецепторных элементов изменение константы Михаэлиса незначительно.Для снижения ошибок анализа обычно ограничиваются использованиемлинейного участка градуировочной кривой (рисунки 36, 37). СогласноуравнениюМихаэлиса–Ментенконцентрациясубстратабудетпропорциональна отклику биосенсора только при концентрациях, гораздоменьших KM. Тогда уравнение приобретает следующий вид:RRmax [ S ]KMИсходя из этого численное значение верхней границы определяемыхконцентраций линейного диапазона равно константе кажущейся Михаэлеса,К´м.1,03Ответ сенсора мгО2/дм мин1,20,80,60,4№1:Содержание дрожжей 5 мг№2: Содержание дрожжей 10 мг№3: Содержание дрожжей 20 мг№4: Содержание дрожжей 40 мг№5: Содержание дрожжей 60 мг0,20,00102030БПК, мг/дм4050603Рисунок 36.

Линейные участки зависимости ответа биосенсора отБПК, при разных содержаниях дрожжей Debaryomyces hansenii в гидрогелемодифицированного ПВС1071,43Ответ сенсора, мг О2/дм мин1,21,00,80,60,4№3: Толщина пленки 0,2 мм№6: Толщина пленки 0,1 мм№7: Толщина пленки 0,05 мм0,20,0010203040БПК, мг/дм3Рисунок 37. Линейные участки зависимости ответа биосенсора отБПК, содержание дрожжей 20 мг на 100 мкл гидрогеля, толщинабиорецепторных элементов от 0,05 до 0,2 мм.Параметры уравнения прямой, аппроксимирующей линейный участокзависимости ответа сенсора от концентрации субстрата для биосенсора наоснове клеток Debaryomyces hansenii, иммобилизованных в химическимодифицированный поливиниловый спирт представлены в таблице 15.Таблица 15. Коэффициенты линейной регрессииПараметрыБиорецепторныйэлемент №1Биорецепторныйэлемент №2Биорецепторныйэлемент №3Биорецепторныйэлемент №4Коэффициентчувствительностиа, мин-1Свободный членуравнения b,мг/дм3 минКоэффициенткорреляции, R0,033 ± 0,0050,048 ± 0,0080,98620,038 ± 0,0040,06 ± 0,010,98760,045 ± 0,0020,12 ± 0,020,99460,0254 ± 0,00060,08 ± 0,010,9974108ПараметрыКоэффициентчувствительностиа, мин-1Свободный членуравнения b,мг/дм3 минКоэффициенткорреляции, R0,0209 ± 0,00060,10 ± 0,010,99660,032 ± 0,0010,06 ± 0,020,99580,0225± 0,00090,06 ± 0,020,9943Биорецепторныйэлемент №5Биорецепторныйэлемент №6Биорецепторныйэлемент №7Длясравненияэффективностиколичественную характеристикубиосенсоровиспользуют– чувствительность.

Для биосенсоровчувствительность определяется, как максимальное значение производнойвеличины ответа биосенсора от концентрации. Чем больше коэффициентчувствительности,темменьшиеколичествакомпонентаможнообнаруживать и определять, получая один и тот же аналитический сигнал,тем точнее можно определить одно и тоже количество вещества [102].В случае амперометрических биосенсоров повысить чувствительностьдатчика можнолибо путем увеличения количества иммобилизованногофермента, либо за счет увеличения истинной поверхности индикаторногоэлектрода на микро уровне (увеличение фактора шероховатости) [103].В настоящей работе чувствительность сенсоров находили как тангенсугла наклона градуировочной прямой в координатах ответ сенсора – БПК(рисунки36,37).Наибольшейчувствительностьюхарактеризуетсябиочувствительный элемент №3 с содержанием дрожжей 20 мг на 100 мклмодифицированного гидрогеля ПВС (толщина биорецепторного элемента 0,2мм).3.3.2.

Нижняя граница определяемых содержаний и предел обнаруженияПредел обнаружения (Cmin) - это наименьшее содержание вещества,которое может быть обнаружено данной методикой с заданной степеньюдостоверности[104].Стандартное109отклонениехолостогоопытарассчитывалось для 10 последовательных измерений ответа сенсора надобавление 100 мкл дистиллированной воды.

Ответ сенсора определяли какпервую производную отклика.Дляхарактеристикивозможностейметодикисточкизренияколичественного анализа используют величину, называемую нижней границейопределяемых содержаний (Cн) [104]. В таблице 16 представлены значенияпредела обнаружения и нижней границы.Таблица 16.Значения предела обнаружения и нижней границыопределяемых содержанийНижняя границаПредел обнаружения,Параметрыопределяемыхмг/дм3содержаний, мг/дм3Биорецепторный элемент №10,20,04Биорецепторный элемент №20,20,08Биорецепторный элемент №30,20,16Биорецепторный элемент №40,30,44Биорецепторный элемент №50,40,60Биорецепторный элемент №60,20,09Биорецепторный элемент №70,40,14Наименьшей нижней границей определяемых содержаний обладаетбиорецепторный элемент №1 с содержанием дрожжей Debaryomyces hansenii5 мг на 100 мкл геля (толщина биочувствительного элемента 0,2 мм).Полученные значения нижней границы определяемых значений БПКпозволяют анализировать образцы воды категории «очень чистая».

Всеразработанные биорецепторные элементы превосходят аналоги на основедрожжей описанные в главе 1 (пункт 1.2.2.1), по значению нижней границыопределяемых концентраций.3.4.3. Рабочий диапазонДлязависимостейгиперболическоговидалинейныйдиапазонограничен снизу нижней границей определяемых содержаний, сверху –концентрацией, равной константе Михаэлиса (таблица 17).110Таблица 17. Рабочий диапазонПараметрыБиорецепторный элемент №1НижняяКажущаясяграницаРабочийконстантаопределяемых диапазон,Михаэлиса, К`m,содержаний,мг/дм3мг/дм3мг/дм36±20,040,04-6Биорецепторный элемент №27±20,080,08-7Биорецепторный элемент №330 ± 30,160,16-30Биорецепторный элемент №447 ± 40,440,044-47Биорецепторный элемент №558 ± 30,600,60-58Биорецепторный элемент №642 ± 20,090,09-42Биорецепторный элемент №741± 30,140,14-41Наибольшим рабочим диапазоном характеризуется биорецепторныйэлемент №5 с содержанием дрожжей 60 мг на 100 мкл химическимодифицированного гидрогеля ПВС (толщина биочувствительного элемента0,2 мм).3.4.4 Операционная стабильностьДляопределенияоперационнойстабильностипроведено15последовательных измерений ответов биосенсоров на добавление ГГС.Объем добавляемой глюкозо-глутаматной смеси был выбран таким образом,что бы ответы лежали в середине линейного участка зависимости ответабиосенсора от БПК.

Временной промежуток между измерениями составлял5-7 минут.111Ответ сенсора, мг О2 /дм3 мин0,320,30,280,260,240,220,202468Номер измерения101214Рисунок 38. Операционная стабильность биосенсора на основеиммобилизованных клеток D. hansenii (биочувствительный элемент №3).Как видно из графика (рисунок 38)ответ биосенсора на основедрожжей Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 иммобилизованных в гидрогельхимическимодифицированногополивиниловогоспиртаостаетсястабильным на протяжение всех 15 измерений (таблица 18).Таблица 18.

Данные по операционной стабильностиСтандартноеОтносительноеотклонение S,стандартноемг/дм3∙минотклонение Sr, %Биорецепторный элемент №10,00443,9Биорецепторный элемент №20,00713,2Биорецепторный элемент №30,00542,0Биорецепторный элемент №40,01412,7Биорецепторный элемент №50,02264,2Биорецепторный элемент №60,01483,0Биорецепторный элемент №70,01292,7Параметр112Наименьшеехарактеристикистандартноеотклонение,операционнойрассчитанноестабильности,полученодлядлябиочувствительного элемента №1, с содержанием дрожжей 5 мг на 100 мклгидрогеля, и составляет0,0044 мг/дм3∙мин.Максимальное стандартноеотклонение зафиксировано для биорецепторного элемента №5, что можетбыть объяснено неравномерностью распределения клеток в пленке, из-забольшого содержания дрожжей (60 мг на 100 мкл геля).Минимальное стандартное отклонение составило 2 % и получено длябиочувствительного элемента с содержанием дрожжей 20 мг на 100 мкл геля(биорецепторный элемент №3).В целом, относительное стандартное отклонение, рассчитанное дляхарактеристики операционной стабильности, биочувствительных элементовна основе дрожжей Debaryomyces hansenii иммобилизованных в гидрогельполивинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном непревышает 4,5%.3.4.5 Долговременная стабильностьЗавремястабильнойработыбиочувствительногоэлементапринимается время, в течение которого величина сигнала составляла неменее 25 % от первоначальной активности.

Графики долговременнойстабильностидля всех биочувствительных элементов представлены нарисунках 39-45.1133Ответ сенсора, мг О 2 /дм мин0,160,140,120,10,080,060,040,02002468101214Время, суткиРисунок 39. Долговременная стабильность биосенсора на основеиммобилизованныхдрожжейDebaryomyceshansenii,биорецепторныйэлемент №1 с содержанием дрожжей 5 мг на 100 мкл гидрогеля.0,253Ответ сенсора, мг О 2 /дм мин0,30,20,150,10,05005101520Время, суткиРисунок 40. Долговременная стабильность биосенсора на основеиммобилизованных дрожжей D. hansenii, биорецепторный элемент №2 ссодержанием дрожжей 10 мг на 100 мкл геля.1140,53Ответ сенсора, мг О 2 /дм мин0,60,40,30,20,1001020304050Время, суткиРисунок 41. Долговременная стабильность биосенсора на основеиммобилизованных дрожжей D. hansenii, биорецепторный элемент №3 ссодержанием дрожжей 20 мг на 100 мкл геля ПВС.0,53Ответ сенсора, мг О 2 /дм мин0,60,40,30,20,100246810Время, суткиРисунок 42.

Долговременная стабильность биосенсора на основеиммобилизованных дрожжей D. hansenii, биорецепторный элемент №4 ссодержанием дрожжей 40 мг на 100 мкл гидрогеля.1153Ответ сенсора, мг О 2 /дм мин0,80,70,60,50,40,30,20,10012345Время, суткиРисунок 43.

Характеристики

Список файлов диссертации