Диссертация (1091617), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Для поддержания оптимальной цитоплазматическойконцентрации калия и стабильного внутриклеточного K+/Na+ коэффициента,клетки используют различные механизмы: строгая дискриминация катионовщелочных металлов на уровне потребления (больше транспортируется ионов136калия, чем натрия), эффективное удаление токсичных катионов из клеток,избирательноепоглощениекатионовворганеллы.ДлядрожжейDebaryomyces hansenii данные механизмы не изучены.Два перегиба на зависимости ответа сенсора от концентрации NaClможно предположительно объяснить сменой механизма поддержаниястабильного внутриклеточного K+/Na+ коэффициента. Таким образом, можноговорить о наличии у дрожжей Debaryomyces hansenii эффективной системырегуляции внутриклеточного осмотического давления, механизм действиякоторой пока не изучен.0,01Ответ сенсора, мгО2/дм3 с0,0090,0080,0070,0060,0050,0040,0030,0020,00100510152025Концентрация NaCl, %Рисунок58.ВлияниеNaClнаиммобилизованной ассоциации дрожжейокислительнуюактивностьO.
angusta BKM Y-1397, A.adeninivorans ВКМ Y-2677 и D. hansenii ВКМ Y-2482Для ассоциации, иммобилизованной в гидрогель модифицированногополивинилового спирта на графике зависимости ответа сенсора отконцентрации NaCl (рисунок 58) можно условно выделить два участка. Напервом участке наблюдается спад окислительной активности до 66 % отпервоначальной. При увеличении солености с 12% до 20% наблюдаетсястабилизация величин откликов сенсора.
Из литературных данных известно,137что дрожжи Debaryomces hansenii иArxula adeninivorans способны кокислению субстратов в присутствие 20% NaCl. Неустойчивость ассоциацииуже при солености среды 12 %, видимо связана с тем, что в ее состав входятмикроорганизмы Ogataea angusta ВКМ Y-1397 чувствительные к наличиюсолей.3.6.4Зависимостьокислительнойактивностидрожжейотприсутствия в системе ионов тяжелых металловИоны тяжелых металлов обладают как бактериостатичным, так ибактерицидным действием.
Механизмы их взаимодействия с ферментамиразличны:замещениенеметаллсодержащихфизиологическиоксианионоввважныхактивныхкатионовцентрахиферментов,связывание функциональных сульфидгидрильных групп и др. [101]. Однойиз важнейших черт металлиндуцированного изменения метаболизма клетокявляется, как правило, снижение активности ряда ферментов. Разныеметаллы вызывают 50%-ю инактивацию большинства ферментов при разныхмолярных концентрациях: Ag+, Hg+, Cu2+ (10–7—10–5) > Cd2+ (10–6–3∙10–5) >Zn2+ (10–5—10–4) >> Pb2+ (10–5–2∙10–4) > Ni2+ (10–5–6∙10–4) > Co2+ (2∙10–4–3∙10–4)[109-110]. Инактивация обусловлена взаимодействием металлов с SHгруппами фермента, в результате чего изменяется его конформация [111].Кроме этого, Cd2+ и Рb2+ могут вытеснять Zn2+, связанный с SH-группами.Для изучения ингибирующего действия соединений тяжелых металловбыла исследованазависимостьокислительнойспособностидрожжейDebaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 и ассоциации дрожжей Ogataea angustaBKM Y-1397, Arxula adeninivorans ВКМ Y-2677 и Debaryomyces hanseniiВКМ Y-2482 от присутствия в растворе ионов Cu2+, Pb2+, Ni2+, Zn2+,Sn2+, Bi3+и Fe3+ в диапазоне концентраций превышающих ПДК рыбхозяйственныхводоемов от 0 до 100 раз.
Измеряемым параметром был ответ биосенсора надобавление ГГС в присутствии солей. В таблице 23 представлены в %138величиныснижения ответов биосенсоров в присутствии соединенийтяжелых металлов.Таблица 23. Влияние ионов тяжелых металлов на окислительнуюактивность дрожжейПредельнодопустимыеСнижение ответа биосенсора, %концентрации ионовБиосенсор на основе Биосенсор на основетяжелых металловдрожжей D.hanseniiПДК Cu2+ =0,001 мг/дм3ПДК Pb =2+0,006 мг/дм3ПДК Ni2+ = 0,01мг/дм3ПДК Zn = 0,012+мг/дм3ПДК Sn2+ = 2мг/дм3ПДК Bi3+= 0,1мг/дм3ПДК Fe3+ = 0,1мг/дм3ассоциации дрожжей10 ПДК14750 ПДК1827100 ПДК315110 ПДК555250 ПДК6668100 ПДК728910 ПДК102650 ПДК3055100 ПДК448810 ПДК222750 ПДК4448100 ПДК536410 ПДК91550 ПДК4754100 ПДК778510 ПДК121150 ПДК3135100 ПДК525010 ПДК332450 ПДК6254100 ПДК8575139Наибольшее влияние на дыхательную активность дрожжей оказываетприсутствие в кювете ионов Pb2+,Fe3+ и Sn2+ , снижении ответов приповышении ПДК в 100 раз составило от 75 до 89%, в зависимости от видабиочувствительного элемента.
Показано, что уже при таких малыхконцентрациях солей свинца в кювете (0,06 мг/ дм3) наблюдается снижениеответа в 2 раза. Сильное влияние олова на дыхательную активность дрожжейобусловлено высокой концентрацией данных ионов в кювете (концентрацияSn2+ на порядки превышает концентрацию других исследуемых ионов).Ионы Ni2+ присутствующие в системе в 100 кратном избытке,относительно ПДК снижают ответ ассоциации дрожжей на 88%, что можетбыть обусловлено снижением окислительной активности дрожжей Ogataeaangusta BKM Y-1397, Arxula adeninivorans ВКМ Y-2677, поскольку дрожжиDebaryomyceshanseniiустойчивофункционируютпривысокойконцентрации ионов никеля (снижение ответов на 44%).При превышении ПДК в 10 раз для всех исследуемых ионов тяжелыхметаллов, кроме Fe3+ и Pb2+, снижение ответов составляет не более 20%, чтоможет свидетельствовать о стресс-устойчивости дрожжей Debaryomyceshansenii.
Устойчивость отдельных ферментов и активация ферментныхсистем, ответственных за стресс-метаболизм, может быть одной извозможных причин нечувствительности дрожжей к избытку тяжелыхметаллов.Замедление скорости дыхания в первую очередь связано сизменением активности дыхательных ферментов. Таким образом, влияниетяжелых металлов на дыхание в большой степени зависит от силывоздействия. Так, умеренный стресс, как правило, не сказывается наинтенсивности дыхания дрожжейили может увеличивать его, тогда каквысокие концентрации заметно снижают скорость этого процесса.Ассоциация дрожжейOgataea angusta, Arxula adeninivorans иDebaryomyces hansenii, подвержена более сильному влиянию ионов тяжелыхметаллов, что может быть связано с резким снижением дыхательнойактивности одного вида дрожжей.140Таким образом, иммобилизованные дрожжи D.
hansenii ВКМ Y-2482и ассоциация дрожжей способны функционировать при солености среды до20% и при наличии ионов тяжелых металлов превышающих ПДК, чтопозволяет использовать их для анализа образцов технологических вод.3.7 Анализ образцов водыПроведен анализ образцов воды с использованием разработанныхбиосенсоров и стандартным методом разбавления. Определение БПК5образцов воды стандартным методом разбавления проводилось согласнодействующимвРФнормативнымдокументам[7].Содержаниерастворенного кислорода до и после пятидневной инкубации определялось спомощью анализатора жидкости «Эксперт – 001».Рисунок 59. Корреляция между значениями БПК, определенными спомощью разработанного биосенсора на основе дрожжей D.
hansenii изначениями БПК, определенными стандартным методом.141Рисунок 60. Корреляция между значениями БПК, определенными спомощью разработанного биосенсора на основе ассоциации дрожжей O.angusta, A. adeninivorans, D. hansenii и значениями БПК, определеннымистандартным методом.Рисунок 61. Корреляция между значениями БПК, определенными спомощью разработанного биосенсора на основе активного ила и значениямиБПК, определенными стандартным методом.142Наибольшая корреляция со стандартным методом (рисунки 59-61)наблюдается для сенсора на основе дрожжей D. hansenii (R=0,9955) иассоциации O.
angusta, A. adeninivorans, D. hansenii(R=0,9988).Важноотметить, что коэффициент корреляции данных, полученных стандартнымметодом и с помощью биосенсора на основе созданных биорецепторныхэлементов выше, чем у большинства описанных аналогов [1-2, 112], где Rварьируется от 0,8400 до 0,9899.Анализируемые пробы представляли собой сточные воды городскихочистных сооружений, отобранные на разных стадиях очистки, сточные водыпищевого комбината, продукты брожения крахмалистого сырья (спиртоваябарда), талые воды с территории металлоперерабатывающего предприятия иповерхностные воды нескольких водоемов Тульской области.Таблица 24.
Анализ образцов водыАнализируемыеобразцыПродуктыброжения,образец №1Продуктыброжения,образец №4Талые водыВода изр.Вашана вышеочистныхсооруженийВода изр.Вашана нижеочистныхсооруженийСточные водыгородскихочистныхсооружений,образец 1O. angusta,АктивныйА.adeninivorans,илD. hanseniiD.hanseniiБПК5 станд.18 200 ± 20018 300 ±20016500±20016000±100033 100 ± 20032 300 ±20031400 ±20030000±200012,8±0,611,3±0,211,1±0,111±2--0,64±0,060,9±0,1--1,4±0,21,8±0,23,7±0,63,1±0,34,0±0,23,5±0,5143АнализируемыеобразцыO. angusta,АктивныйА.adeninivorans,илD.
hanseniiСточные водыгородскихочистныхсооружений,образец 2Болотная водапос. КлюкваБолотная водапос. ОзерныйВода из пруда,образец №1Вода из пруда,образец №2D.hanseniiБПК5 станд.71±568±361,6±0,460±1025±424±518±122±621±420±419±118±3--1,8±0,11,9±0,2--2,9±0,22,9±0,3Для всех разработанных биосенсоров значения БПК различаются незначимо со значениями БПК5, полученными стандартным методом с учетомдоверительных интервалов (таблица 24). БПК-биосенсоры на основеассоциации дрожжей и активного ила не позволяют анализировать образцыводы со значениями БПК5 ниже 2,5 мг/дм3, что ограничивает их применениедля анализа образцов воды категории «чистая».3.8 Использование результатов исследования для созданияэкспериментального образца биосенсорного анализатора БПК«Эксперт – 009»Наосновеполученныхвработерезультатовпосозданиювысокоэффективного биокатализатора совместно с малым инновационнымпредприятиемОООэкспериментальный«Эконикс–Эксперт»образецразработанамперометрическогоиизготовленбиосенсорногоанализатора для экспресс - определения БПК на основе дрожжей D.
hanseniiВКМ Y-2482 иммобилизованных в гидрогель химически модифицированногополивинилового спирта.144Результатыработыположенныевосновусозданиявысокоэффективного биокатализатора:1.выбран биологический материал для формирования рецепторногоэлемента биосенсора на основе индивидуальной культуры из 10 дрожжевыхштаммов (Ogataea angusta ВКМ Y-1397, Debaryomyces hansenii BKM Y-2482,Debaryomyces hansenii ВКМ Y-1050, Debaryomyces hansenii ВКМ Y-111,Debaryomyces hansenii ВКМ Y-1585, Arxula adeninivorans ВКМ Y-2677,ArxulaadeninivoransВГИ 78-6, Candida boidinii ВКМ Y-2356, Candidamaltosa ВКМ Y-2359, Сandida blankii ВКМ Y-2675) по спектру окисляемыхсубстратов, устойчивости при иммобилизации на кислородном электроде иоперационной стабильности.Наилучшими характеристиками обладаетБПК-биосенсор на основе дрожжей Debaryomyces hansenii BKM Y-2482:наибольшей долговременной стабильностью (до 35 суток), высокойоперационной стабильностью (3,2%) и широким спектром окисляемыхорганических соединений.2.составлены устойчивые во времени (более 20 суток) 2искусственные ассоциации из дрожжей родов O.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
