Диссертация (1091617), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Так,единичный анализ БПК с помощью всех разработанных рецепторныхэлементов требует меньших временных затрат по сравнению с другимимоделямибиосенсорныхиндивидуальнойкультурыанализаторовдрожжей[1].Биосенсорпревосходитнаосновепрототипыподолговременной стабильности, субстратной специфичности и нижнейгранице определяемых значений БПК5.Поскольку субстратная специфичность составленных ассоциации исоставляющих ее микроорганизмов может отличаться, была проведенаоценка субстратной специфичности рецепторных элементов на основесозданных ассоциаций микроорганизмов.
Кроме этого, профиль субстратнойспецифичности микроорганизмов может изменяться в зависимости отспособа иммобилизации (капсулирование в диализную мембрану (рисунок12913) и включение в гидрогель модифицированного ПВС (рисунок 52)), в связисразнойдоступностьюферментныхсистемидиффузионнымиограничениями.Ответ биосенсора, %O.angusta+A.adeninovoransO.angusta+A.adeninovorans+D.hanseniiD.hanseniiАктивный ил100806040200л л -1 -1 1 2 1 н т за за а а за за за ь а а а а а А я л л н н н н а а ) я яно ано ол ол ол- ол- ол- ери рби ло ко тоз нозкто аро кто нал лот лот лот лот лот ДТ али ено еноици ери ами ози лот лотлый три триает Эт ан ан ан ан ан ц о си ю ак ан у х а та ис ис ис ис ис Э к ф ф л С т ир ис ис с на наМ роп Бут роп роп бут Гли C К ГлГал М Фр Са Л Ме я к я к я к я к я к зоат тро тро Г Глу Т я к я к оки С БСа а н Дп п лва ва ва ва на ен -Ни иниПов нов оля Д ДДил тил етиБ 4 -Дно ано дио дио оннтае еги ами н(сет Эт тан пан имм,4рМ -М 3-М2аМ Э о Лп ут ни2 2Ас Гл ргиПрАРисунок 52.
Субстратная специфичность ассоциаций микроорганизмови дрожжей Debaryomyces hansenii BKM Y-2482 иммобилизованных вполивиниловый спирт модифицированный N-винилпирролидоном.Наиболее широкой субстратной специфичностью обладают дрожжи D.hansenii BKM Y-2482, т.к. способны окислять все анализируемые классыорганических веществ, которые могут находиться в образцах водыразличного происхождения. Также широкой субстратной специфичностьюобладает ассоциация, состоящая из 3 видов дрожжей Ogataea angusta BKMY-1397, Arxula adeninivorans ВКМ Y-2677, Debaryomyces hansenii BKM Y2482.
Данная ассоциация окисляет моно- и дисахариды, одноатомные имногоатомные спирты, карбоновые кислоты, аминокислоты и некоторыеароматические соединения. Бензоат натрия (пищевая добавка, оказывающаяугнетающее действие на дрожжи путем подавления активности ферментов вклетке) и п-нитрофенол (распространенный промышленный токсикант)окисляются только ассоциацией O. angusta, A. adeninivorans, D. hansenii.Биорецепторные элементы на основе дрожжей Debaryomyces hansenii BKMY-2482 и ассоциации дрожжей Ogataea angusta BKM Y-1397, Arxula130adeninivorans ВКМ Y-2677, Debaryomyces hansenii BKM Y-2482 выбраны какнаиболееперспективные,посколькуобладаюширокойсубстратнойспецифичностью, превосходят мировые аналоги [1-2, 108], и могут бытьиспользованы для анализа образцов воды различного происхождения.3.6 Влияние состава исследуемых проб на окислительнуюспособность дрожжей Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 иассоциации дрожжей O.
angusta, A. adeninivorans, D. hansenii3.6.1 Влияние pH-средыpH среды является одним из факторов, влияющих на активностьклеточных ферментов и чувствительность биорецептора к различнымсубстратам. Исследовано изменение окислительной активности дрожжейD.hansenii (рисунок 53) и ассоциации дрожжей O. angusta, A. adeninivorans,D. hansenii (рисунок 54)при варьировании pH от 5,6 до 7,8 (нижней иверхней границами возможных pH буферной системы KH2PO4/Na2НPO4). Вкачестве субстрата была выбрана глюкозо-глютаматная смесь, которуюприменяютвкачествестандартавРоссийскойФедерацииивмеждународной практике при определении БПК5.Ответ сенсора, мгO2/дм3 мин0,60,50,40,30,20,10,05678рНРисунок 53.
Зависимость ответа биосенсора на основе дрожжейD.hansenii, иммобилизованных методом включения в гидрогель от рН среды1310,018Ответ сенсора мгО2/дм3 с0,0160,0140,0120,010,0080,0060,0040,00205678pHРисунок 54. Зависимость ответа биосенсора от рН среды для ассоциациидрожжей Ogataea angusta BKM Y-1397, Arxula adeninivorans ВКМ Y-2677 иDebaryomyceshanseniiВКМY-2482,включенныхвгидрогельмодифицированного ПВСПоказано (рисунок 53), что максимальный ответ биосенсора на основедрожжей D. hansenii ВКМ Y-2482 наблюдается в интервале рН 6,8-7,2. Политературным данным известно, что дрожжи D.
hansenii способны к роступри pH от 4.0 до 7.0 [55]. При иммобилизации ассоциации дрожжей Ogataeaangusta BKM Y-1397, Arxula adeninivorans ВКМ Y-2677 и Debaryomyceshansenii ВКМ Y-2482 в гидрогель модифицированного ПВС максимальныйответ биосенсора наблюдаетсяв интервале рН 6,8-7,2 (рисунок 54).Полученный диапазон рН для обоих биочувствительных элементов являетсяприемлемым при анализе большинства образцов воды.3.6.2 Определение зависимости окислительной активности дрожжей оттемпературы средыТемпература является важным фактором жизнедеятельности всехдрожжей. Для каждой из различных функций дрожжевых клеток: дыхания,брожения,роста—существуют132оптимальные,минимальныеимаксимальные температурные условия.
По классификации поведениямикроорганизмов при различных температурах различают психрофильные,мезофильные и термофильные микроорганизмы. Дрожжи чаще всего относятк двум группам микроорганизмов: психрофильным (оптимум температурниже 20°С) и мезофильными (оптимум температур между 20°С и 45°С). Вдействительности эти пределы зависят от вида дрожжей и даже рода.В данной работе исследован характер изменения откликов биосенсоровпри изменении температуры от 5°С до 40°С. Все измерения проводились втермостатируемой ячейке с помощью кислородного электрода Кларка. ВработевыявленызависимостиокислительнойактивностидрожжейDebaryomyces hansenii (рисунок 55) и ассоциации дрожжей (рисунок 56) оттемпературы.Ответ сенсора, мг O2 /дм3 мин0,60,50,40,30,20,10,001020304050оТемпература, СРисунок55.Зависимостьответабиосенсораиммобилизованных дрожжей D.
hansenii от температуры.133наоснове0,123Ответ сенсора мг/дм с0,100,080,060,040,020,0001020304050Температура, ОСРисунок 56. Влияние температуры на окислительнуюактивностьиммобилизованной ассоциации микроорганизмов Ogataea angusta BKM Y1397, Arxula adeninivorans ВКМ Y-2677 и Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482Показано,наблюдаетсячтомаксимальныйответдляобоихбиосенсоровв интервале температур от 15°С до 25°С. При понижениитемпературы до 10°С наблюдается резкое понижение (на 50 % отмаксимальнозафиксированной)иммобилизованныхвдыхательнойполивиниловыйспирт,активностидрожжей,модифицированныйN-винилпирролидоном.
Это объясняется тем, что при понижении температуры,уменьшается скорость реакции, и следовательно, замедляется процессобразования комплекса между ферментами и субстратами. В литературе [55]показано, что дрожжи Debaryomyces hansenii способны к росту при низкихтемпературах(10°С).ДрожжиArxulaadeninivoransявляютсятермотолерантными и способны к росту при температуре до 48 (10°С) [69].Наибольшееснижениедыхательнойактивностинаблюдаетсяпритемпературе 40°С, и может быть обусловлено денатурацией белка входящегов состав дрожжей.Таким образом, для процессов дыхания дрожжей Debaryomyceshansenii и ассоциации дрожжей Ogataea angusta BKM Y-1397, Arxula134adeninivoransВКМиммобилизованныхY-2677виDebaryomycesполивиниловыйспирт,hanseniiВКМY-2482,модифицированныйN-винилпирролидоном, оптимальным является интервал температур от 15°С до25°С, соответствующий комнатной температуре.
Однако, для уменьшенияпогрешности при определении БПК с использованием биосенсора на основеиммобилизованных дрожжей Debaryomyces hansenii, связанной с изменениемтемпературного режима необходимо создание системы термостатирования.3.6.3 Зависимость окислительной активности дрожжей от присутствия всистеме хлорида натрияИз литературных данных известно [45-46], что дрожжи Debaryomyceshanseniiвыделеныизсоленыхсред,такихкакморскаявода,концентрированные рассолы, соленая пища. Они относятся к одним из самыхгалотолерантных видов дрожжей, т.е. они могут расти в среде, содержащей 4М NaCl (23%). Дрожжи A.
adeninivorans также относятся к галотолерантнымвидам дрожжей [70]. Для дрожжей O. angusta данной особенности невыявлено.Соленость среды прежде всего, влияет на давление внутри клетки.Зависимость ответа сенсора от концентрации NaCl отражает способностьклеток к окислению в средах с высоким осмотическим давлением.В ходе эксперимента исследована окислительная способность дрожжейпри различных концентрациях NaCl (от 0,5% до 25%).
При повышениисолености среды происходит незначительное уменьшение концентрациирастворенного кислорода.1350,7Ответ сенсора, мгО2/дм3 мин0,60,50,40,30,20,10,00510152025Концентрация NaCl в кювете, %Рисунок57.ВлияниеконцентрацииNaClнаокислительнуюактивность дрожжей Debaryomyces hanseniiНа полученной диаграмме (рисунок 57) можно условно выделить триучастка. Первый участок при содержании соли от 0,5 % до 2%, второй – от2% до16%, третий участок – от 16% до 25%. На первом участке наблюдаетсярезкий спад окислительной активности.
При увеличении солености с 2% до16% наблюдается незначительное снижение величины отклика сенсора. Придальнейшем увеличении концентрации соли наблюдается резкое понижениеокислительной активности дрожжей Debaryomyces hansenii. При 25%концентрации соли NaCl отклик биосенсора понизился до 92%.Из литературных данных известно, что дрожжи Debaryomyces hanseniiв присутствии NaCl, накапливают высокие концентрации Na+ внутри клетки.При обычных условиях концентрация ионов калия внутри клетки выше,поэтому слишком высокая внутренняя концентрация Na+ как правило,токсична для клеток.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
