Автореферат (1091615)
Текст из файла
На правах рукописиЮДИНА НАТАЛЬЯ ЮРЬЕВНАБИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ДРОЖЖЕВОЙ КУЛЬТУРЫИ АССОЦИАЦИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКОГОПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)АВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата химических наукМосква - 2017Работа выполнена на кафедре химии естественнонаучного института Федеральногогосударственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования«Тульский государственный университет».Научный руководитель:кандидат химических наук, доцент,заведующий кафедрой химии, директорестественнонаучного институтаФедерального государственного бюджетногообразовательного учреждения высшегообразования «Тульский государственныйуниверситет»Алферов Валерий АнатольевичОфициальные оппоненты:доктор химических наук, профессор,профессор кафедры химии Федеральногогосударственного бюджетного образовательногоучреждения высшего образования «Липецкийгосударственный технический университет»доктор биологических наук, профессор,зам.
директора по научной работе, заведующийлабораторией биотехнологии и физиологиифототрофных организмов Федеральногогосударственного учреждения науки «Институтфундаментальных проблем биологии РАН»Ермолаева Татьяна НиколаевнаЦыганков Анатолий АнатольевичВедущая организация:Федеральное государственное бюджетное образовательноеобразования «Вятский государственный университет»учреждениевысшегоЗащита диссертации состоится 24 апреля 2017 года в 15 ч 00 мин на заседанииДиссертационного Совета Д 212.131.06 на базе Федерального государственного бюджетногообразовательного учреждения высшего образования «Московский технологическийуниверситет» по адресу 119571, Москва, проспект Вернадского, д.86, ауд. М-119.С авторефератом диссертации можно ознакомиться на интернет-сайтах ВАК РФhttp://vak.ed.gov.ru и https://mirea.ru.С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке Федеральногогосударственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования«Московский технологический университет» по адресу: 119554, Москва, проспектВернадского, д.78 и на интернет сайте https://mirea.ru.Автореферат разослан «2017 г.»Ученый секретарь Диссертационного Совета,кандидат химических наук,старший научный сотрудникА.И.
Лютик21. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность работыВ настоящее время актуальной является разработка методов иаппаратуры для экспресс-анализа природных и сточных вод. Одним изпараметров, определяющим интегральную загрязненность воды, являетсябиохимическое потребление кислорода (БПК). Стандартная методикаопределения БПК требует инкубирования насыщенной кислородом пробы втечение 5 или 20 суток (БПК5 или БПК20). В соответствии с мировойпрактикой эффективным подходом для экспресс-оценки БПК являетсяразработка биосенсоров на основе микроорганизмов, окисляющих широкийкруг органических веществ (Jouanneau, 2014), за рубежом создан рядкоммерческих БПК-биосенсоров на основе биореакторов.Для создания биочувствительных элементов БПК-сенсоров используютлибоассоциациимикроорганизмов(активныйил,искусственныеконсорциумы), способные окислять широкий спектр органических соединений,однако БПК-биосенсоры наих основе недостаточно стабильны из-заизменения состава консорциума (Арляпов, 2011); либо индивидуальныекультуры микроорганизмов с определенными потребительскими свойствами(стабильность при работе, способность окислять различные классыорганических веществ, устойчивость при иммобилизации и к воздействиюнегативных факторов окружающей среды) (Abrevaya, 2014).Ключевым моментом в формировании стабильного биочувствительногоэлементаБПК-биосенсора является иммобилизация микроорганизмов.Эффективные методы получения иммобилизованных клеток связаны спроцессами включения их в природные и синтетические гидрогели,протекающими, как правило, в мягких условиях и обеспечивающими высокийуровень диффузии субстратов и продуктов, а также невозможность для клетокпокинуть матрицу.
В качестве синтетического гелеобразователячастоиспользуют поливиниловый спирт (ПВС), однако его применение в качествеосновы рецепторного элемента биосенсорного анализатора затруднено, так какон образует тонкие, растворимые в воде пленки с низкой механическойпрочностью. Одним из подходов для создания сетчатых структурполивинилового спирта является введение сшивающих агентов. Получениемеханическипрочныхпленокгидрогелясиммобилизованнымимикроорганизмами обеспечит технологическую возможность тиражированиярасходных биочувствительных элементов для модификации кислородных3электродов оксиметров амперометрического типа.
Таким образом, для созданиябиосенсора для экспресс-определения БПК в первую очередь необходимопроизвести выбор эффективного биокатализатора и способ его иммобилизации.Цель работыРазработка биотехнологических основ создания амперометрическогобиосенсора для экспресс-определения биохимического потребления кислородана основе индивидуальной культуры и ассоциаций микроорганизмов.Задачи исследования1.Выбратьбиологическийматериал,составляющийосновубиочувствительного элемента БПК-биосенсора, по способности дрожжей родовOgataea, Candida, Debaryomyces, Arxula окислять широкий спектр органическихсубстратов, по устойчивости при иммобилизации на кислородном электроде истабильности при работе.2.Разработать полимерную матрицу на основе поливинилового спирта,модифицированного N-винилпирролидоном для создания нерастворимогосетчатого материала, подходящего для иммобилизации микроорганизмов, чтообеспечит технологические возможности тиражирования расходныхбиочувствительных элементов.3.Составить устойчивые во времени искусственные ассоциациимикроорганизмов, создать на их основе рецепторные элементы и определитьхарактеристики БПК-биосенсоров.
Сравнить основные характеристикибиосенсоров на основе индивидуальной культуры, искусственных иестественных (активный ил) ассоциаций микроорганизмов, иммобилизованныхвгидрогельполивиниловогоспиртамодифицированногоNвинилпирролидоном.4.Изучить влияние особенностей состава исследуемых проб (рH, соленостьи присутствие соединений тяжелых металлов)и условий анализа(температуры) на окислительную способность дрожжей, иммобилизованных вмодифицированный ПВС.5.Разработать методику определения БПК с использованием биосенсорногоанализатора.6.Провести апробацию БПК-биосенсоровна образцах природных источных вод и сравнить результаты со стандартным методом. На основеполученных результатов совместно с ООО «Эконикс-Эксперт» разработатьэкспериментальный образец биосенсорного анализатора БПК.4Научная новизна работыПоказано, что иммобилизация микроорганизмов, происходящаянепосредственновпроцессеформированиясетчатойструктурыполивинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном, позволяетполучать биочувствительные гидрогели для использования в биотехнологии.Методом ЯМР-спектроскопии установлена структура поливинилового спиртасшитого при участии N-винилпирролидона.Впервые проведено сравнение основных характеристик микробныхамперометрических биосенсоров на основе индивидуальной культуры,искусственных и естественных (активный ил) ассоциаций микроорганизмов,иммобилизованных в гидрогель поливинилового спирта, модифицированногоN-винилпирролидоном.Впервые установлено, что дрожжи Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482способны к окислению широкого спектра органических веществвсильносоленых средах и при наличии ионов тяжелых металлов вконцентрациях, превышающих ПДК, что позволяет использовать их длясоздания биочувствительных элементов биосенсоров.Практическая значимость работыИммобилизация целых клеток микроорганизмов в гидрогельполивинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном, позволяетполучать стабильные биокатализаторы, которые можно использовать длясерийного изготовления биораспознающих элементов сенсоров.Сформированы биосенсоры кюветного типа для определениябиохимического потребления кислорода на основе индивидуальной культуры иассоциациймикроорганизмов,характеризующиесявысокойчувствительностью и экспрессностью, превосходящие мировые аналоги поданным характеристикам.
Работа вносит практический вклад в разработкубыстрых методов анализа на основе биосенсоров и позволяет в перспективепроизводить недорогие и эффективные анализаторы воды.Совместно с малым инновационным предприятием ООО «Эконикс–Эксперт» изготовленэкспериментальный образец амперометрическогобиосенсорного анализатора для экспресс-определения БПК, в результате чегоразработка подготовлена к промышленному выпуску.Разработана и аттестована в Госстандарте методика определения БПК сиспользованием биосенсорного анализатора.5По результатам работы получено 2 патента: патент на полезную модель№ 117918 от 28.10.2011 «Устройство для определения степени загрязненияводы биоразлагаемыми органическими веществами», патент на полезнуюмодель № 164144 от 21.10.2015 «Устройство для экспресс-анализа индексабиохимического потребления кислорода».Основные положения, выносимые на защиту1.Результаты формирования биочувствительных элементов биосенсоров наоснове микроорганизмов, иммобилизованных в гидрогель поливиниловогоспирта, модифицированного N-винилпирролидоном.2.Результаты создания эффективного биокатализатора для оценки индексаБПК на основе дрожжей Debaryomyces hansenii, окисляющих широкий спектрорганических соединений и устойчивых к высокому содержанию NaCl и ионовтяжелых металлов, что позволяет определять БПК в широком диапазоне вобразцах воды различного происхождения, в том числе и технологическихсточных водах с повышенным содержанием ионов тяжелых металлов.3.Результаты составления ассоциаций микроорганизмов, устойчивых втечение длительного времени, на основании различий субстратнойспецифичности и сходства удельных скоростей роста.4.Методика определения БПК с использованием биосенсорногоанализатора с иммобилизованными микроорганизмами.Апробация работыРезультаты работы докладывались на Московском международномконгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011,2013, 2015 гг.) (медали конкурса); Всероссийской конференции с элементаминаучной школы для молодежи «Экотоксикология» (Тула, 2011 (дипломпобедителя конкурса), 2012, 2013, 2014 (диплом победителя конкурса), 2016; IXВсероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды«Экоаналитика-2014» (Светлогорск, 22 – 28 июня 2014 г.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
