Автореферат (1091615), страница 2
Текст из файла (страница 2)
(диплом победителяконкурса));Всероссийскойнаучно-практическойконференциисмеждународным участием «Биодиагностика состояния природных и природнотехногенных систем» (Киров, 2009, 2011, 2014 гг.); «Методы анализа иконтроля качества воды» (Москва, 6 июня 2012 г.); IV международнойконференции «Биотехнология: наука и практика» (Ялта, 20-24 сентября 2016г.).Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 статей в изданиях,рекомендованных ВАК, из них 2 статьи в индексируемых в Web of Science, 8сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.6Место проведения работы.
Работа выполнялась на кафедре химииЕстественнонаучного института ФГБОУ ВО Тульского государственногоуниверситета при поддержке ФЦП «Исследования и разработки поприоритетным направлениям развития научно-технологического комплексаРоссии на 2014-2020 годы», соглашение № 14.574.21.0062 и государственногозадания в сфере научной деятельности Минобрнауки РФ (Задание №2014/227,проект № 1764). Автор работы является победителем конкурса Программы«Участник молодежного научно-инновационного конкурса», реализуемойФондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-техническойсфере в 2011 г. (№10022р/16818, г. Тула).Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 168страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзоралитературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов,списка публикаций, списка литературы, включающего 112 источников.
Работасодержит 65 рисунков и 24 таблицы.2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫI. ВведениеВо введении обоснована актуальность выбранной темы, сформулированыцель и задачи исследования, раскрыта научная новизна и практическаязначимость работы, указана апробация исследовательской работы и количествопубликаций.II. Литературный обзорВ главе приводится анализ научно-технической литературы,посвященной исследованиям в области разработки БПК-биосенсоров,микробиологии дрожжей, использования гидрогелей в различных областяхнауки и техники.III.
Экспериментальная частьОбъекты исследованияВ работе использованы: штаммы дрожжей Debaryomyces hansenii ВКМY-2482, Debaryomyces hansenii ВКМ Y-1050, Debaryomyces hansenii ВКМ Y111, Debaryomyces hansenii ВКМ Y-1585, Arxula adeninivorans ВКМ Y-2677,Arxula adeninivorans ВГИ 78-6, Candida boidinii ВКМ Y-2356, Candida maltosaВКМ Y-2359, Сandida blankii ВКМ Y-2675, Ogataea angusta ВКМ Y-1397(Всероссийская коллекция микроорганизмов ИБФМ им.
Г.К. Скрябина РАН).7Синтез полимерной матрицы на основе поливинилового спирта,модифицированного N-винилпирролидономДля синтеза поливинилового спирта, модифицированногоNвинилпирролидоном использовали 5% водной раствор ПВС, водный раствораммоний-церий(IV) нитрата (NH4)2Ce(NO3)6 в качестве инициатора и Nвинилпирролидон в качестве сшивающего агента. Модификацию проводилипри постоянном перемешивании в атмосфере азота при температуре 40°С.Регистрация ЯМР-спектровРегистрация ЯМР спектров выполнялась в Центре магнитнойспектроскопии Института биохимической физики им. Н.М.
Эмануэля РАН.Работа выполнена на спектрометре Bruker Avance III 500 с рабочей частотой попротону 500.2 МГц. Регистрировались спектры водного раствора реакционнойсмеси при комнатной температуре с добавлением 10% D2O (для стабилизациирезонансных условий), и с подавлением сигнала воды. Химические сдвиги 1Hкалибровали относительно сигнала тетраметилсилана. Для обработки спектровприменялось программное обеспечение TOPSPIN 3.0 фирмы Bruker.Иммобилизация дрожжейДля иммобилизации с применением диализной мембраны проводилипредварительное разбавление биомассы дрожжей фосфатным буфернымраствором в соотношении 1:1.
5 мкл полученной суспензии наносили надиализную мембрану D9777 (Sigma, США) и фиксировали на поверхностикислородного электрода с помощью резинового кольца.Для получения биокатализатора иммобилизованного в гидрогельполивинилового спирта модифицированного N-винилпирролидоном к 100 мклгеля добавляли 20 мг клеток (смешанных в соотношении 1:1 или 1:1:1 дляассоциаций состоящих соответственно из 2-х или 3-х видов) микроорганизмов.Равномерного распределения клеток в гидрогеле добивались встряхиванием нацентрифуге Sky line Elmi Centrifuge & Vortex CM70M (ELMI, Латвия) в течение5 минут.
Полученную суспензию переносили в планшет (d=5 мм) и оставлялидо высыхания при температуре 18-220 С. Высохший биокатализаторфиксировали на поверхности электрода Кларка с помощью нейлоновой сетки.Биосенсорные измеренияКлеточное дыхание, возникающее при окислении субстрата,регистрировали с помощью преобразователя - многофункциональногоанализатора рН-метр-иономер-БПК-термооксиметрЭксперт-001 (ООО«Эконикс-Эксперт», Москва), в режиме «термооксиметр», используя8кислородный электрод Кларка, на поверхности которого расположенбиочувствительный элемент. Измеряемым параметром (ответом биосенсора)являласьмаксимальнаяскоростьизмененияконцентрации кислорода вовремени(мгО2/дм3с).Измерения проводили вкювете объемом 5 см3 сиспользованиемнатрийкалиевогофосфатногобуферного раствора.Рисунок 1.
Макет БПК-биосенсора на основе кислородного электродаСканирующая электронная микроскопия (СЭМ)Анализ образцов ПВС, модифицированного N-ВП, содержащих и несодержащих клетки микроорганизмов проводили с помощью сканирующегоэлектронного микроскопа JSM-6510 LV («JEOL», Япония).IV. Результаты и их обсуждение1. Выбор биологического материала для создания БПК-биосенсора наоснове индивидуальной культуры микроорганизмовВыбор биологического материала, составляющего основу рецепторногоэлемента БПК-биосенсора, производился по способности микроорганизмовокислять широкий спектр органических субстратов, по устойчивости прииммобилизации на кислородном электроде и стабильности при работе.Проведена оценка субстратной специфичности дрожжей (рисунок 2) сиспользованием органических соединений, которые могут быть обнаружены вобразцах природных и сточных вод.
Дрожжи D. hansennii ВКМ Y-2482 и ВКМY-111 характеризуются наиболее широкой субстратной специфичностью иокисляют вещества большой группы представленных классов органическихсоединений, в которую входят спирты, углеводы, аминокислоты иповерхностно-активные вещества, нитрофенолы, которые могут бытьобнаружены в сточных водах (рисунок 2). Однако низкие ответы биосенсора наоснове дрожжей D. hansennii ВКМ Y-111 на этанол снижают возможность егоприменения.
Дрожжи D. hansennii ВКМ Y-1585 и ВКМ Y-1050 хорошоокисляют моно- и дисахариды, но практически не окисляют спирты иглутаминовую кислоту.9Ответ биосенсора, %100806040200A.adeninivorans ВГИ 78-6метанолглюкозаглицинA.adeninivorans ВКМ Y-2677C. boidinii ВКМ Y-2356этанолфруктозадодецилсульфат натрияС. maltosa ВКМ Y-2359пропанолсахарозабензоат калияC. blankii ВКМ Y-2675глицеринглутуминовая кислота4-нитрофенолОтвет биосенсора, %100806040200D.hansenii ВКМ Y-2482D.hansenii ВКМ Y-111D.hansenii ВКМ Y-1585D.hansenii ВКМ Y-1050O.angusta ВКМ Y-1397Рисунок 2.
Субстратная специфичность иммобилизованных дрожжейДля портрета субстратной специфичности метилотрофных дрожжей видаOgataea angusta ВКМ Y-1397, характерно окисление низших спиртов, однако,поверхностно- активные вещества, нитрофенолы, а также распространеннаяпищевая добавка – бензоат калия, не подвергаются окислению данным видомдрожжей. Дрожжи вида Arxula adeninivorans (ВГИ 78-6 и ВКМ Y-2677) неспособны окислять метанол и глицерин. Профили субстратной специфичностидрожжей Candida boidinii ВКМ Y-2356, Candida maltosa ВКМ Y-2359 и Сandidablankiii ВКМ Y-2675 характеризуются низкими или отсутствующими ответамина метанол, дисахариды, аминокислоты и поверхностно-активные вещества.Характеристикой устойчивости микроорганизмов при иммобилизацииявляется долговременная стабильность, которая определяет работу сенсора втечение длительного периода времени.
Она зависит от природы биоматериала иот способа иммобилизации клеток, поэтому для сравнения долговременнойстабильности выбрана иммобилизация с применением диализной мембраны,что позволяет обеспечить работу биоматериала в наиболее мягких условиях.Показано (таблица 1), что лучшей долговременной (35 суток) иоперационной (3,2%) стабильностью, характеризующей устойчивость работысенсора при проведении большого числа последовательных измерений,обладает биосенсор на основе микроорганизмов Debaryomyces hansenii BKM Y2482.10Таблица 1. Основные характеристики биочувствительных элементов на основеиммобилизованных дрожжейКоличество Долговременная Операционнаяокисляемыхстабильность, стабильность,субстратовсутки%(из 12)O.
angusta ВКМ Y-13978264,4А.adeninivorans ВКМ Y-26778323,3А. adeninivorans ВГИ 78-68274,7С. boidinii ВКМ Y-23566124,5C. maltosa ВКМ Y-23598164,2C. blankii ВКМ Y-26756144,6D. hansenii ВКМ Y-248212353,2D. hansenii ВКМ Y-11112153,9D. hansenii ВКМ Y-15859103,7D. hansenii ВКМ Y-10507173,9На основе полученных результатов для дальнейших исследований посозданию биочувствительного элемента на основе индивидуальной культурымикроорганизмов были выбраны дрожжи Debaryomyces hansennii ВКМ Y-2482характеризующиесянаибольшейдолговременнойиоперационнойстабильностью, а также широкой субстратной специфичностью.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
