Автореферат (1091615), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Для всех ассоциациймикроорганизмов значение нижней границы определяемых концентрацийблизко к 2,5 мг/дм3 и является приемлемым при анализе большинства образцовводы.Чувствительность биосенсора на основе индивидуальной культурыдрожжей D. hansenii ВКМ Y-2482 на порядок превышает чувствительностьбиосенсоров на основе ассоциаций микроорганизмов, что влияет на такиеважные метрологические характеристики, как предел обнаружения и нижнююграницу определяемых концентраций (таблица 3).Биосенсор на основе дрожжей D. hansenii ВКМ Y-2482 позволяетанализировать образцы воды категории чистые и очень чистые (нижняяграница определяемых содержаний БПК составляет 0,16 мг/дм3) и имеетвысокую долговременную стабильность - 42 суток.Важно отметить, что данные биосенсоры по характеристикам не тольконе уступают аналогам (Abrevaya, 2014; Liu, 2015), но и частично превосходятих.
Так, единичный анализ БПК с помощью всех разработанныхбиочувствительных элементов требует меньших временных затрат посравнению с другими моделями биосенсорных анализаторов. Биосенсор наоснове индивидуальной культуры дрожжей превосходит прототипы подолговременной стабильности, субстратной специфичности и нижней границеопределяемых значений БПК5.5. Влияние состава исследуемых проб на окислительную способностьдрожжейDebaryomyceshanseniiВКМY-2482иассоциациимикроорганизмов O.
angusta, A. adeninivorans, D. hanseniipH среды является одним из факторов, влияющих на активностьклеточных ферментов и чувствительность биорецептора к различнымсубстратам. Исследовано изменение окислительной активности дрожжейD.hansenii (рисунок 7) и ассоциации дрожжей O. angusta, A. adeninivorans, D.hansenii при варьировании pH от 5,6 до 7,8. Показано, что максимальный ответбиосенсоров на основе сформированных биорецепторных элементовнаблюдается в интервале рН 6,8-7,2, что является приемлемым при анализебольшинства образцов воды.160,6Ответ сенсора, мг O 2 /дм3 минОтвет сенсора, мгO 2/дм3 мин0,60,50,40,30,20,10,50,40,30,20,10,05670,08010рН20304050Температура, оСРисунок7.Зависимостьответа Рисунок 8. Зависимость ответа биосенсорабиосенсора на основедрожжей на основедрожжей D.hansenii отD.hansenii от рН средытемпературыИсследован характер изменения откликов биосенсоров при изменениитемпературы от 5°С до 40°С (рисунок 8). Показано, что для процессовокисления дрожжей Debaryomyces hansenii и ассоциации дрожжейоптимальным является интервал температур от 15°С до 25°С.
Однако, дляуменьшения погрешности при определении БПК с использованием биосенсорана основе иммобилизованных дрожжей Debaryomyces hansenii, связанной сизменением температурного режима рекомендовано создание системытермостатирования.Из литературных данных известно, что дрожжи Debaryomyces hansenii иArxula adeninovorans относятся к галотолерантным видам дрожжей, т.е. онимогут расти в среде, содержащей до 4 М NaCl (23%).Таблица 4. Влияние состава исследуемых проб на окислительную способностьиммобилизованных дрожжейКонцентрация NaCl/ионы металловСнижениеответа биосенсора, %Биосенсор на основедрожжей D.hanseniiБиосенсор на основеассоциации дрожжей10%NaCl20%NaCl10100ПДК ПДКCu2+ Cu2+ПДК =0,001мг/дм310100ПДК ПДКPb2+Pb2+ПДК =0,006мг/дм310100ПДК ПДКZn2+ Zn2+ПДК =0,01мг/дм3100100ПДК ПДКFe3+Fe3+ПДК =0,1 мг/дм333%67%14%31%55%72%22%53%33%85%61%67%6%51%51%88%3%64%24%75%В ходе эксперимента исследована способность дрожжей и их ассоциацийокислять ГГС при различных концентрациях NaCl (от 0,5% до 25%).
Снижениеокислительной активности ассоциации на 60% при солености среды 10 %,видимо, связано с тем, что в ее состав входят дрожжи O. angusta ВКМ Y-1397чувствительны к наличию соли NaCl.Для изучения ингибирующего действия соединений тяжелых металловбыла исследована зависимость окислительной способности дрожжей17Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 и ассоциации дрожжей Ogataea angustaBKM Y-1397, Arxula adeninovorans ВКМ Y-2677 и Debaryamyces hansenii ВКМY-2482 от присутствия в растворе ионов Cu2+, Pb2+, Ni2+, Zn2+,Sn2+, Bi3+ и Fe3+ вдиапазоне концентраций превышающих ПДК рыбхозяйственных водоемов от 0до 100 раз. Наибольшее влияние на дыхательную активность дрожжейоказывает присутствие ионов Pb2+, Fe3+ и Sn2+ (таблица 4).
При концентрациивсех изучаемых ионов тяжелых металлов равной 10 ПДК, кроме Fe3+ и Pb2+,снижение ответов биосенсора на основе дрожжей Debaryomyces hanseniiсоставляет не более 20%, что может свидетельствовать о их стрессустойчивости. Ассоциация дрожжей Ogataea angusta, Arxula adeninovorans иDebaryomyces hansenii, подвержена более сильному влиянию ионов тяжелыхметаллов, что может быть связано с резким снижением дыхательнойактивности одного вида дрожжей. Таким образом, иммобилизованные дрожжиD. hansenii ВКМ Y-2482 и ассоциация дрожжей способны функционироватьпри солености среды до 20% и при наличии ионов тяжелых металловпревышающих ПДК, что позволяет использовать их для анализа образцовтехнологических стоков.6.
Анализ образцов водыПроведен анализ образцов воды, с использованием разработанных БПКбиосенсоров и стандартным методом разбавления (таблица 5).Таблица 5. Анализ образцов водыАссоциациядрожжей O.angusta,Анализируемые образцыA.adeninovorans иD. hanseniiАктивныйилD.hanseniiБПК5 станд.12±118 300 ±20032 300 ±20011,3±0,216000±100030000±200011±2--16500±20031400 ±20011,1±0,10,64±0,06--1,4±0,21,8±0,24±13,1±0,34,0±0,23,5±0,560±1068±361,6±0,460±1019±315±2-24±520±4-18±119±11,8±0,12,9±0,222±618±31,9±0,22,9±0,3Продукты брожения, образец №117 800 ± 300Продукты брожения, образец №432 400 ± 500Талые водыВода из р.
Вашана вышеочистных сооруженийВода из р. Вашана нижеочистных сооруженийСточные воды городскихочистных сооружений, № 1Сточные воды городскихочистных сооружений, № 2Болотная вода пос. КлюкваБолотная вода пос. ОзерныйВода из пруда, образец №1Вода из пруда, образец №2180,9±0,1Анализируемые пробы представляли собой сточные воды городскихочистных сооружений, продукты брожения крахмалистого сырья (спиртоваябарда), сточные воды пищевого комбината, поверхностные воды несколькихводоемовТульскойобластииталыеводыстерриторииметаллоперерабатывающего завода.
Для всех разработанных БПК-биосенсоровзначения БПК различаются не значимо со значениями БПК5, полученнымистандартным методом. БПК-биосенсоры на основе ассоциации дрожжей иактивного ила не позволяют анализировать образцы воды со значениями БПК5ниже 2,5 мг/дм3, что ограничивает их применение для анализа образцов водыкатегории «чистая».7.Использование результатов исследования для созданияэкспериментального образца биосенсорного анализатора БПК «Эксперт –009».На основе полученных в работе результатов по созданиювысокоэффективного биокатализатора совместно с малым инновационнымпредприятиемООО «Эконикс–Эксперт»разработаниизготовленэкспериментальный образец амперометрического биосенсорного анализаторадля экспресс - определения БПК на основе дрожжей D.
hansenii ВКМ Y-2482иммобилизованныхвгидрогельхимическимодифицированногополивинилового спирта, способных стабильно (относительное стандартноеотклонение не выше 2 %) работать длительное время (40 дней), окислятьширокий круг органических веществ (33 субстрата), функционировать привысокой солености среды (до 20 %) и наличии ионов тяжелых металлов.Предприятием ООО «Эконикс–Эксперт» проведена разработкаструктурной схемы прибора, доработка измерительного преобразователя,создана новая конструкция кислородного датчика для достижениямаксимальной точности при измерении растворенного кислорода, разработанфиксатор биорецепторного элемента, создано программное обеспечениепозволяющее проводитьизмеренияБПК и калибровку биосенсора вавтономном режиме (без подключения к персональному компьютеру) и вполевых условиях,для корректной работы биосенсора при любыхтемпературахсозданасистематермостатирования.Разработанныйэкспериментальный образец амперометрического биосенсорного анализаторадля экспресс - определения БПК «Эксперт-009» находится на испытаниях.19V.
Выводы1. Для формирования биочувствительного элемента биосенсора на основеиндивидуальной культуры выбраны дрожжи Debaryomyces hansennii ВКМ Y2482. Биосенсор на их основе обладает наилучшими характеристиками:наибольшей долговременной стабильностью (до 35 суток), высокойоперационной стабильностью (относительное стандартное отклонение не выше3,2%) и широкой субстратной специфичностью.2. Гидрогели на основе поливинилового спирта, модифицированного Nвинилпирролидоном, образуют сетчатую структуру, позволяющую включатьклетки микроорганизмов при сохранении ими жизнеспособности ибиокаталитических свойств, что обеспечивает технологические возможноститиражирования расходных биочувствительных элементов.3.
На основании различий субстратной специфичности и сходства удельныхскоростей роста составлены искусственные ассоциации из дрожжей O. аngusta,А.adeninivorans и D. hansenii, устойчивые в течение 20 суток. При сравненииосновных характеристик БПК-биосенсоров показано, что биосенсор на основемикроорганизмов D. hansenii ВКМ Y-2482, характеризующийся наибольшейдолговременной стабильностью (42 дня), превосходит БПК-биосенсоры наоснове ассоциаций и известные мировые аналоги на основе дрожжей почувствительности и нижней границе определяемых концентраций (0,16 мг/дм3).4. Показано, что дрожжи D. hansenii способны функционировать наэлектроде в широком диапазоне рН, при наличие NaCl (до 25%) и ионовтяжелых металлов (до 100 ПДК), что позволяет применять их для определенияБПК в образцах промышленных сточных вод.5. Проведено определение БПК с использованием разработанных БПКбиосенсоров в образцах воды в широком интервале БПК (от 0,9 до 30000мг/дм3).
Результаты работы положены в основу нормативной документации длясоздания методики биосенсорного определения БПК и разработкиэкспериментального образца биосенсорного анализатора БПК «Эксперт – 009».VI. Список опубликованных научных работ по теме диссертацииРаботы, опубликованные в изданиях, индексируемых в Web of Science1. V.A. Arlyapov, N.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
