Диссертация (1091617), страница 14
Текст из файла (страница 14)
в углеродном спектре) идвух СН(9) группы: 5.57 и 5.85 м.д. (56.2 и 71.3 м.д. в углеродном спектре).Кросспики между протонами СН и СН3 групп в спектре COSY и HMBC, атакже корреляция между карбонильными углеродами и СН протонами (вHMBC)позволяютсделатьвыводоналичиивполимереэтилпирролидонового фрагмента.CHCH2OHnCHCH2OOCHCNCH3Два набора сигналов этилпирролидонового фрагмента по-видимомуобъясняется наличием в молекуле двух типов этилпирролидоновыхфрагментов менее стерически напряженного (А) и более стерическинапряженного (В).CH2CHOCH2HCOOCH2HCHCАCH2 OHCCHCHOOHCNHCOHCH2CHHCВCH2 ONCNOCH2OCHCNCH2CH3CH2CCOH2CCH2CNCH2OOCHCNCH3CH3 OHCCNOCH2CHCH2n94Поскольку сигналов других групп в спектрах не наблюдается, мыможем говорить об установлении структуры получающегося полимера.Соотношение фрагментов в сополимере с повышенным содержанием Nвинилпирролидона (соотношение компонентов ПВС: инициатор: N-ВП =160:70:10) схематично можно представить следующим образом:При модификации поливинилового спирта меньшим количествомN-винилпирролидона (соотношение компонентов ПВС : инициатор : N-ВП= 160 : 7 : 1), получающийся сополимер имеет другую структуру исоотношение входящих в нее фрагментов.Рисунок31.Н1ЯМР-спектрполивиниловогоспиртамодифицированного N-винилпирролидоном (соотношение компонентовПВС : инициатор : N-ВП = 160 : 7 : 1).95Углеродный спектр полимера с соотношением компонентов ПВС :инициатор : N-ВП = 160 : 7 : 1 не регистрировался из-за низкойконцентрации.В отличии от протонного спектра сополимера с соотношениемкомпонентов ПВС : инициатор : N-ВП = 160 : 70 : 10 (рисунок 26) вспектре на рисунке 31 сополимера с соотношением компонентов ПВС :инициатор : N-ВП = 160 : 7 : 1 мы видим только один набор сигналовэтилпирролидоновой группы.
В остальном спектры идентичны (заисключением интегральной интенсивности сигналов). Проинтегрировавсигналы протонного ЯМР спектра (рисунок 31) мы можем посчитатьсоотношение фрагментовструктураполучающегосяв получающемся полимере. Соответственно,сополимераможетбытьпредставленаследующим образом:Химические сдвиги сигналов сополимера представлены в таблице 12.96Таблица 12. 1Н и 13С спектры поливинилового спирта модифицированного N-винилпирролидономНомерпротона/СН2 (1)СН2 (2)СН2 (3)СН2 (4)СН (5)СН (6)СН (7)СН2 (8)СН (9)СН3 (10)5.561.32СОуглеродаПВС : инициатор : N-ВП = 160:70:103.391Н2.33(8.2 т.)2.09 (8.2 п.)(8.2 т.)3.42-3.592.01 (8.2 п.)2.45(уш.м.)С1342.5 44.11.27 м.4.823.86-4.063.86-4.061.50-1.70(6.5 к.)(6.5 д.)уш.
суш. суш. с5.851.40(7.5 к.)(7.5 д.)56.214.3178.271.318.4181.9(8.2 т.)17.029.717.130.619.798.572.4-74.362.8-66.142.0-42.7-ПВС : инициатор : N-ВП = 160:7:13.381Н(8.2 т.)3.48(уш.м.)2.00(8.2 п.)2.072.31(8.2 т.)2.411.28 м.4.843.86-4.063.86-4.061.50-1.705.561.32уш. суш. суш. с(6.5 к.)(6.5 д.)-(8.2 т.)Протоны ОН групп находится в обмене с водой и его сигнал в спектрах не видны.Химические сдвиги даны в миллионных долях.
В скобках – константы спин-спинового взаимодействия (J) в герцах.Расщепление обозначено: д – дублет, т – триплет, к.- квартет, п. -пентет, уш.м – уширенный мультиплет, уш.с. –уширенный сигналы.Таким образом, на основании структуры получаемых сополимеровможно предположить следующий механизм протекания реакции сшивкиполивинилового спиртаN-винилпирролидоном с участием ионов Ce+4 вкачестве инициатора. На первой стадии происходит восстановление ионовцерия с образованием оксильных радикалов. Вероятно, при изменениисоотношения исходных компонентов меняется количество образующихсяоксильных радикалов в структуре полимера.CH+ Ce+4CH2OHCHCH2OHnCH+ Ce+3 + H+CH2OnДалее образовавшиеся на первой стадии оксильные радикалывзаимодействуютсN-винилпирролидономсобразованиемполимер-радикалов.
Данный процесс сопровождается разрывом двойной связи C=C,чтотакже подтверждается методом ИК-спектроскопии (исчезновениеполосы валентных колебаний при частоте 1625 см-1).CHHCCH2OHn+CH2HCNOCCH2CHOOHCH2CH2CHOnOCHCNCH2Частьобразовавшихся полимер-радикалов после присоединенияпротона превращается в этилпирролидоновую группу.CHOHCH2CHnOCH2OCH2NCHOHCHCH+CH2nCHCH2OOCHCNCH3Затем происходит сшивка - рекомбинация образовавшихся полимеррадикалов, которая может протекать по нескольким направлениям:1. Поскольку оксильные радикалы, образующиеся на первой стадиипри восстановлении ионов церия способны вести реакции роста цепи за счетотрыва атомов водорода от всех СН-связей поливинилового спирта, можетобразовываться следующая структура:CHCH2CHOHnCH2CHOCH2OHCnCH2OHПрисоединение полимер-радикалов может идти по следующемумеханизму:CHCH CH2OHCHCH2OHCHnOCH2+CHCH2OHOnCHCCOHOHCNH2CNCHCH2COHСшивкаOCCH2CH22.nCH2полимер-радикаловсnоксильнымиCH2OHnрадикалами,образовавшимися на 1-ой стадииCHCH2OHCHOHCH2CHnOCH2CHOHOCHC+CH2CHnCHnCH2CH2OOHCNCH2COONCHCH2OHCH2CHnCH2n3.
Сшивка одинаковых полимер-радикалов, образовавшихся на 2-ойстадии или присоединение радикала к этилпирролидоновой группе. Обапроцесса приводят к одному продукту (сополимеру):99CHCH2OHCHnOCH2+CHOHOnCHCCHCH2NCH2CHOHCCH2OHOCHCCH2CHCH2CHn OOHCNNCH2CH2+CHCHCH2nOOHOCHCNCH2nCH2 OCH2OOHCNCCH3CCH2HCOHCH2OHCH CH2CNOCHnCH2nВ результате реакции протекающей по предложенному механизму(путь 1-3) происходит образование связи >СH–O–CH<, которая в ИКспектрах дает 3 характерных полосы поглощения (1136 см-1, 935 см-1 и 917см-1).
Подтверждением механизма является образование в ИК-спектрахсополимеров, в отличие от смеси ПВС и N-ВП, третьей полосы поглощения(1136 см-1) и исчезновение полосы поглощения 1625 см-1, подтверждающейразрыв двойных связей С=С в N-винилпирролидоне (рисунок 19).Единственным путем протекания данной реакции является третийпроцесс, поскольку в ЯМР-спектрах нет сигналов других продуктов.Для трех образцов сополимеров с различным мольным соотношениемкомпонентов (ПВС, инициатор, N-винилпирролидон) проведено изучениеструтуры методом сканирующей электронной микроскопии (рисунок 32).А) ПВС : инициатор : N- А) ПВС : инициатор : А) ПВС : инициатор :ВП = 160 : 7 : 1N-ВП = 160 : 7 : 2N-ВП = 160 : 70 : 10Рисунок 32.
Фотографии набухшего гидрогеля поливиниловогоспирта, модифицированного N-винилпирролидоном при различных мольныхсоотношениях компонентов.100ВрезультатемодификацииполивиниловогоспиртаN-винилпирролидоном формируется гидрогель сетчатой структуры (рисунок32) с различными размерами пор, в зависимости от мольного соотношенияисходных компонентов. Так для соотношения ПВС : инициатор : N-ВП = 160: 7 : 1 образуется сополимер обладающий однородной структурой, размерпор которого варьируется от 2 до 5 мкм (рисунок 32 А). При незначительномувеличении доли сшивающего агента (ПВС : инициатор : N-ВП = 160 : 7 : 2)видимого изменения размеров пор в набухшем гидрогеле не наблюдается(размер пор от 1 до 6 мкм) (рисунок 32 Б).
В сополимере с высокимсодержанием N-винилпирролидона(соотношение компонентов ПВС:инициатор: N-ВП = 160:70:10) (рисунок 32 В) происходит формированиеструктурысбольшимколичествомсшивок.Такимобразом,дляиммобилизации микроорганизмов может быть использован сополимер ссоотношением компонентов ПВС : инициатор : N-ВП = 160 : 7 : 1, так какобладает однородной структурой и размер пор варьируется от 2 до 5 мкм.3.4 Иммобилизация дрожжей D.
hansenii ВКМ Y-2482 вгидрогель поливинилового спирта, модифицированного NвинилпирролидономДля иммобилизации дрожжевых клеток Debaryomyces hansenii ВКМ Y2482 выбранполимерный носитель (соотношениякомпонентов ПВС :инициатор : N-ВП = 160 : 7 : 1) на основе поливинилового спирта,модифицированного N-винилпирроидоном.На рисунке 33 представлены фотографии Debaryomyces hansenii ВКМY-2482 в свободном и иммобилизованномсканирующей электронной микроскопии.101виде, полученные методомА) ДрожжиDebaryomyces hanseniiВКМ Y-2482Б) ВысушенныйВ) Набухший гидрогельгидрогель ПВС с N-ВППВС с N-ВП сс иммобилизованнымииммобилизованнымидрожжами D.
hanseniiдрожжами D. hanseniiВКМ Y-2482ВКМ Y-2482Рисунок 33. Фотографии дрожжей Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 игидрогеля ПВС с N-ВП с иммобилизованными дрожжами.ВрезультатемодификацииполивиниловогоспиртаN-винилпирролидоном формируется гидрогель сетчатой структуры (рисунок32) с размерами пор от 1 до 5 мкм, что позволяет включать клетки дрожжейD. hansenii имеющие размер 3-4 мкм (рисунок 33А).
Как видно из рисунка33Б дрожжи Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 занимают весь объемгидрогеля.Подбор оптимального содержания дрожжей Debaryomyces hansenii вгидрогеле модифицированного поливинилового спирта является важнойзадачей,т.к.содержаниебиоматериалавлияетна чувствительностьбиосенсора. Изготовлено 7 биочувствительных элементов с содержаниемдрожжей от 5 до 60 мг на 100 мклмодифицированного гидрогеляполивинилового спирта, и толщиной от 0,05 до 0,2 мм (таблица 13).102Таблица 13. Содержание дрожжей D.
hansenii в биочувствительномэлементе№СодержаниеОбъем гидрогелябиорецепторного дрожжей D. поливинилового спиртаэлементаhanseniiмодифицированного Nвинилпирролидоном15 мг100 мклТощинабиорецепторногоэлемента, мм0,2 мм210 мг100 мкл0,2 мм320 мг100 мкл0,2 мм440 мг100 мкл0,2 мм560 мг100 мкл0,2 мм620 мг100 мкл0,1 мм720 мг100 мкл0,05 ммВыбороптимальногополивиниловогоспирта,содержаниядрожжеймодифицированноговгидрогелеN-винилпирролидономпроизводился по нескольким параметрам, таким как операционная идолговременная стабильность, коэффициент чувствительности и диапазонопределяемых значений БПК.Все характеристики определяли с использованием смеси глюкозы иглутаминойвой кислоты (ГГС) с концентрацией 150 мг/дм3 каждогокомпонента (суммарно 300 мг/дм3, что соответствует БПК=205 мг/дм3,согласно ПНДФ [7], таким образом БПК=0,68∙С(ГГС)).
Глюкозо-глутаматнаясмесь (ГГС) была выбрана, так как её применение как стандарта при анализеБПК определено в ПНДФ [7].При введении субстрата в измерительную кювету происходит егоокисление микроорганизмами, вследствие чего увеличивается дыхательнаяактивностьдрожжей,ивприэлектродномпространствеснижаетсяконцентрация растворенного кислорода, что регистрируется с помощьюкислородного электрода Кларка.1033.4.1 Зависимость ответа биосенсора от биохимического потребелениякислородаПо экспериментальным данным построены зависимости откликабиосенсора от БПК в измерительной кювете.Ответ сенсора, мг О2/дм3 мин2,52,01,51,0№1:Содержание дрожжей 5 мг на 100 мкл геля№2: Содержание дрожжей 10 мг на 100 мкл геля№3: Содержание дрожжей 20 мг на 100 мкл геля№4: Содержание дрожжей 40 мг на 100 мкл геля№5:Содержание дрожжей 60 мг на 100 мкл геля0,50,0050100150200250300БПК, мг/дм3Рисунок 34. Зависимости ответа биосенсора от БПК, при разномсодержании дрожжей Debaryomyces hansenii в гидрогеле модифицированногоПВС1042,03Ответ сенсора мг О2/дм мин2,51,51,0№3: Толщина пленки 0,2 мм№6: Толщина пленки 0,1 мм№7: Толщина пленки 0,05 мм0,50,0050100150200250БПК, мг/дм3Рисунок 35.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
