Диссертация (1091617), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Основные методы иммобилизации.1.4.1 Иммобилизация клеток путем включения в массу носителяНаиболее эффективным методом иммобилизации живых клетокявляется включение их в гели. Полимерные гели предотвращаютвымывание клеток микроорганизмов и обеспечивают доступ субстратов икислорода.54Гель – система полимер-растворитель, пространственная сеткакоторой стабилизирована по всему своему объему устойчивыми вовремени межмолекулярными связями. Природа этих связей определяетсяхимическимстроениемсоответствующихгелеобразователейгелей.Оченьиважнаяспособамирольполученияпринадлежитиудерживаемому полимерной сеткой растворителю, который предотвращаетколлапс системы в компактную массу и обеспечивает диффузиюрастворимых веществ в гель или из него [4].Различают гели 1-го и 2го рода.
Пространственная сетка полимерныхгелей 1-го рода образована ковалентными связями (химические сетки).Хорошоизвестнымипримерамитакихматериаловявляютсяполиакриламидные гели, силикагель, гели типа сефадексов (поперечносшитые декстраны), полистирольные ионообменные смолы и др. В гелях 2го рода пространственная сетка поддерживается за счет сил нековалентнойприроды(водородныесвязи,гидрофобныевзаимодействия,зонаобразования кристаллитов; это – физические сетки). Примерами такихсистем являются гели желатины, агара и агарозы, крахмала и др.
Даннымгелевым матрицам присуще обратимое плавление – застудневание приизменении температуры, поэтому их обычно называют термообратимыми.Существуют полимеры, растворы которых желируют при охлаждении(наиболее распространены), но есть высокомолекулярные соединения,растворы которых превращаются в гели при нагревании (например, водныерастворы метилцеллюлозы).К недостаткам, связанных с использованием гелевых матрицотносится:трудоемкостьнеобходимостьмикроорганизмаизготовленияспециальногоусловийподборарецепторногодляиммобилизации,каждогоснижениеэлемента,конкретногопластическойпрочности гелей после иммобилизации [76].
Однако, несмотря на это,включение клеток в полимерные гели и синтетические мембраны может55успешноприменятьсяприформированиирецепторныхэлементовбиосенсоров для определения широкого спектра соединений [75].1.4.2 ГидрогелиГидрогели это трехмерно сшитые гидрофильные полимерные сетки,способные к набуханию до 99% от сухой массы без диссоциации.Взависимости от типа сшивки, гидрогели можно разделить на два класса:химически и физически сшитые гидрогели. Химические гидрогелиобразованы ковалентными связями и не растворяются в воде безразрушения этих связей[77].
Физические гидрогели, формируютсядинамическими сшивками синтетического или природного происхожденияна основе нековалентных взаимодействий, таких как гидрофобные иэлектростатические взаимодействия или водородными связями [78].Гидрофильные и инертные гидрогели зачастую применяют для созданиябиосовместимых матриц, за счет отсутствия воздействияна белки иклетки [75].Нековалентная сшивка(физическая)_MsРазмерячеекПереплетение(физическое)ГидрогельРисунокКовалентная сшивка(химическая)9.Структурасшитогогидрогеля(Ms–средняямолекулярная масса полимера между точками сшивания).Если сетчатый полимер наделен функциональными группами, тогидрогель на его основе может реагировать на физические, химические ибиохимические изменения [75]. Для корректировки свойств гидрогелейможно использовать различные типы сшивки, варьировать степеньсшивания, что повлечет изменение плотности цепи в пространстве.56Например, более высокая степень сшивки приводит к повышениюмеханической прочности и уменьшению скорости диффузии, тем самымуменьшая размер ячеек.
Размер сетки (размер ячеек) используется дляопределения диффузионного пространства, доступного для переносамолекул через матрицу гидрогеля (рисунок 9) [79].Гидрогелям свойственно набухание в водных растворах за счетгидрофильности полимеров и осмотического давления [75]. Процесснабухания происходит в три этапа: (I) диффузия молекул воды черезматрицу, (II) гидратация полимерных цепейполимерных ячеек [80].и (III) расширениеСтепень набухания (максимальное количествопоглощаемой воды) может меняться в зависимости от условий среды (рН,температуры, ионной силы) илиизменения плотности поперечныхсшивок, вследствие нарушения баланса.
Высоко поперечно-связанныегидрогели имеют меньший размер ячеек и набухают меньше по сравнениюс неплотно сшитыми гидрогелями. Кинетика набухания гидрогелейзависит от механизма проникновения растворителя в матрицу, иконтролируетсялибодиффузией,либоустановлениемградиентаконцентраций [75].Высокоесодержаниеводыиминимальноевлияниепривзаимодействии с биологическими молекулами, имеют важное значениедля применения гидрогелей при создании биохимических сенсоров.1.4.3 Использование гидрогелей в биодатчикахГидрогели могут быть получены в виде водных растворов спомощью УФ- или термо-инициируемой радикальной полимеризации, сприменением дополнительных реагентов, пептидов, водородных мостиковили ДНК [75].Некоторые гидрогели чувствительны к малейшим изменениям вокружающей среде, и способны моментально давать ответ на малейшеефизическое воздействиетемпературы, света, давления, электрическогополя, ионной силы, и магнитного поля.
Измеряемыми параметрами в таких57сенсорах могут быть уменьшение размера, уменьшение плотности сшивки,а также увеличение содержания ионных групп, и размеров пор [75].1.4.5 Гидрогели в биосенсорахВысокое содержание воды и гидрофильная природа гидрогелейделает их похожей на внеклеточный компонент матрикс.
Вследствие чегогидрогели являются биосовместимыми и могут применяться в различныхбиомедицинских материалах, например, для создания мягких контактныхлинз и систем доставки лекарств [75]. В 2006 году опубликован обзор оприменение гидрогелей в биологии и медицине [81], а вопубликованподробныйобзороприменение2010 годугидрогелейвбиомедицинских устройствах [82].Следовательно, гидрогели в биосенсорике могут применяться дляпокрытиядеталейдатчика,чтобыпредотвратитьнежелательноевзаимодействие с биологическими молекулами или клетками.
Их открытаяпористая структура и гидрофильные свойства позволяют свободнодиффундироватьтемнеаналитуменее,диффузиячерезкрупныхгидрогельмолекул,матрицы,такихкакбелки,может быть ограничена и даже полностью исключена. Кроме простойзащиты, гидрогели могут быть использованы в качестве матрицыиммобилизации элементов биодатчиков.дляГидрогели применяются приразработке биосенсоров с высокой селективностью и чувствительностьрецепторов, которые должны быть иммобилизованы в их нативнойконформации,чтобыпроисходилосвязываниесанализируемымвеществом.
Иммобилизация в гидрогели позволяет сохранять активностьи функциональность ферментов, клеток и других биомолекул [67].1.4.6 Биосенсоры на основе ферментов, иммобилизованных в гидрогелиВ статье [83] описан биосенсор для определения метанола в нгексаненаосновеалкогольоксидазыиммобилизованных в полимернуюипероксидазыхрена,гидрогелевую матрицу силикагеля.58Диапазон определяемых концентраций метанола составил 2.3-90 мМ,сенсор устойчиво функционировал в течение 45 измерений и более 2-хнедель в потоковом режиме измерений.Вработе[84]полиэтиленгликоляописаноразличнойполучениеформыимикрочастицразмеровдлягидрогелявключенияразличных ферментов (например, глюкозооксидазы и алкогольоксидазы,для обнаружения глюкозы и этанола, соответственно).В работе [85] описан датчик на основе кислородного электродаКларка и иммобилизованной биферментной системы в поли (карбамоил)сульфонатный гидрогель для косвенной детекции мочевины.Разработаноогромноеиммобилизованноговполидиметилсилоксан,количестворазличныебиосенсоровгидрогелинаоснове(полиэтиленгликоль,полиэтиленгликольдиакрилат,ферментаглюкозооксидазы для количественного определения глюкозы в крови [75].Матрицы на основе гидрогелей полиэтиленгликоля применяют длясоздания биосенсоров для обраружения пероксида водорода.
В работе [86]описан новый тип композитного гидрогеля (золь-гель) на основекремниевого ICA-золя и привитиго спополимера поливинилового спирта(ПВС) с 4-винилпиридином для создания биосенсора на пероксидводорода. Данная система проявляла высокую чувствительность 15мМ-1 ипредел обнаружения 15 . 10-7 М.1.4.7 Биосенсоры на основе целых клеток микроорганизмов,иммобилизованных в гидрогелиИспользование микроорганизмов в создании биосенсоров, дает рядпреимуществ:способность обнаруживать широкий спектр химическихвеществ, податливость к генетической модификации, широкая рабочаяобласть температур и рН. В обзоре [87] описаны приемуществаиспользования иммобилизованных целых клеток в электрохимических,амперометрических,потенциометрических,59кондуктометрических,оптических, биолюминесцентных, флуоресцентных и колориметрическихмикробных биосенсорах, а также микробных биосенсоров типа топливныхэлементов.
В качестве основы для иммобилизации различных клеток вгидрогели применяются различные вещества: полиакриламид, полиуретан,фото сшиваемыесмолы, поливиниловый спирт, полиакрилонитрил иполиэтиленгликоль, альгинат, каррагинан, агароза с низкой температуройплавления,хитозаниразличныебелковыематрицы.Однимизприемуществ использования гидрогелей является высокое содержаниеводы и трехмерная полимерная сеть, которая позволяет осуществлятьактивный газообмен и транспорт питания к клеткам, иммобилизованным вгидрогель. Эти характеристики в сочетании с их биосовместимостью,позволяют даже культивировать клетки или бактерии внутри гидрогелей[75].Целыеклеткиприменяютдлябыстрогоопределениябиохимического потребеления кислорода [1].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
