Диссертация (1091617), страница 10
Текст из файла (страница 10)
На основе солеустойчивыхдрожжей Arxula adeninivorans LS3 иммобилизованных в гидрогельполикарбамоилсульфонат и кислородного электрода Кларка созданбиосенсро для определения БПК [28]. Другим примером использованиядрожжевых клеток иммобилизованных в гидрогелевые матрицы являютсяволоконно-оптические биосенсоры на основе люминесцентных дрожжейиммобилизованных в альгинат кальция, или в гидрогель поливиниловогоспирта [88]. Благодаря защитным свойстам матрицы гидрогеля, показанавозможность работы в нестерильных условиях. Показано что дрожжиSaccharomycesсerevisiaeиммобилизованныевгидрогельполикарбомоилсульфоната способны к окислению глюкозы, фруктозы,галактозы,сахарозыпродемонстрировалииксилозывозможность[89].Авторыиммобилизациистатьи[90]аэробныхмикроорганизмов выделенных из морской воды в гидролель на основеполиуретана для определения растворенного органического углерода.60Экспрессность созданного биосенсора составила 1-3 минуты, а времяфункционирования сенсора составило 2 недели.Кроме биосовместимости и высокого коэффициента диффузиигидрогелиобладаютструктурнымсходствомстакназываемымвнеклеточным матриксом, что позволяет применять их как in vivo, так иin vitro.
Применение гидрогелей в тканевой инженерии описано в обзореБиосовместимость[91].модифицикациейихсгидрогелейможетопределеннымибытьбиомолекулами,увеличенакоторыеподдерживают иммобилизацию клеток, или уменьшают воспаление тканив случае имплонтации датчика.Заключение по разделуВпоследнеераспространениедесятилетие,гидрогелив области биосенсорикиполучилиогромное[75].
Этому явлениюпоспособствовали многие свойства гидрогелей, но самое главное из нихэто, высокое содержание воды (что делает их биологически совместимыми позволяет диффундировать растворимым в воде соединениям черезполимерную сетку); химическое разнообразие и возможность физическойи химической модификации. Все это позволяет создавать чувствительныегидрогели, которые могут действовать сами как датчики, например, путемвведения гидрофобных групп для температурной чувствительности илипротонных группы для чувствительностик рН, а также путемиммобилизации в гидрогели различных биомолекул и целых клеток длясоздания высокочувствительных биосенсоров.Гидрогели могут быть получены в виде водных растворов спомощью различных механизмов, наиболее важные из которых УФ илитемпературное инициирование, методы радикальной полимеризации.Огромное разнообразие высокомолекулярных соединений, а также их61сочетаний, позволяет создавать гидрогели практически с любымипараметрами.Создание нерастворимых гидрогелей за счет химической сшивкиспециальными реагентами может позволить создавать матрицы любойструктуры, сжелаемыми параметрами и геометрией, для созданиявысокочувствительных биокатализаторов на основе иммобилизованныхмикроорганизмов.622.
Экспериментальная часть2.1 Получение поливинилового спирта, модифицированного NвинилпирролидономДля синтеза поливинилового спирта, модифицированногоN-винилпирролидоном использовали 5% водной раствор ПВС марки №16/1(Россия), водный раствораммоний-церий (IV) нитрата (NH4)2Ce(NO3)6(ч.д.а., ТУ 6-09-4762-84, Россия) в качестве инициаторавинилпирролидон (99%, ACROSORGANICS,США)и N-в качествесшивающего агента. Модификацию проводили при температуре 40°С ватмосфере аргона в течение 1-6-ти часов.Для приготовления 5 % водного раствора поливинилового спирта к20 мл водыпостепенно, при перемешивании и нагревании (40°С)добавлялиг полимера1дополногорастворения. Соотношениякомпонентов для модификации ПВС представлены в таблице 8.Таблица 8.
Объемные и мольные соотношения компонентов реакцииОбъемные соотношения, мл(ПВС: инициатор : N-ВП)20 : 0,8 : 0,120: 0,4 : 0,120 : 0,2 : 0,120 : 0,1 : 0,120: 0,8 : 0,220 : 0,8 : 0,05Мольные соотношения(ПВС: инициатор : N-ВП)160 : 7 : 1160 : 3,5 : 1160 : 1,75 : 1160 : 0,875 : 1160 : 7 : 2160 : 7 : 0,52.2 Регистрация ИК-спектровРегистрациюИК-спектровполивиниловогоспирта,модифицированного N-винилпирролидоном проводили на инфракрасномФурье-спектрометре ФМС 1201 (ООО «Мониторинг», Россия).632.3 Регистрация ЯМР-спектров модифицированногополивинилового спирта и исходных веществРегистрация ЯМР спектров выполнялась в Центре магнитнойспектроскопии Института биохимической физики им. Н.М.
Эмануэля РАН.Работа выполнена на спектрометре Bruker Avance III 500 с рабочимичастотами м 500.2 МГц и 125.8 МГц по протону и углероду,соответственно.Регистрировались спектры водного раствора реакционной смеси прикомнатной температуре с добавлением 10% D2O (для стабилизациирезонансных условий), и с подавлением сигнала воды. Химические сдвиги1H и13С калибровали относительно сигнала тетраметилсилана.
Вседвумерные эксперименты проводились по стандартным методикам фирмыBruker. Для обработки спектров применялось программное обеспечениеTOPSPIN 3.0 фирмы Bruker.2.4 Определение доли сшитого поливинилового спирта,модифицированного N-винилпирролидономОпределениедолисшитогополимерапроводилиметодомэкстракции. Для этого проводили взвешивание высушенного образцамассой от 0,01 до 0,02 г, заливали водой и перемешивали в течение 2часов, при t = 60ºC. После экстракции воду отделяли центрифугированиеми сушили исследуемые образцы до постоянной массы при t=600C.Экстракцию повторяли несколько раз, до получения постоянной массыобразца после высушивания.
Для каждого образца было изготовлено по 4пленки. Потерю веса в % по массе определяли по формуле:где m1- масса до экстракции,m2 - масса высушенного гидрогеля после экстракции.642.5 Культивирование клеток микроорганизмовШтаммыдрожжей Ogataea angusta ВКМ Y-1397, Debaryomyceshansenii BKM Y-2482, Debaryomyces hansenii ВКМ Y-1050, DebaryomyceshanseniiВКМ Y-111, Debaryomyces hanseniiadeninivoransВКМ Y-2677, ArxulaВКМ Y-1585, ArxulaadeninivoransВГИ 78-6, Candidaboidinii ВКМ Y-2356, Candida maltosa ВКМ Y-2359, Сandida blankii ВКМY-2675, были получены во Всероссийской коллекции микроорганизмовИнститута биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.
Активный илбыл отобран с очистных сооружений города Тулы.Дрожжи Debaryomyces hansenii BKM Y-2482, Debaryomyces hanseniiВКМ Y-1050, Debaryomyces hansenii ВКМ Y-111, Debaryomyces hanseniiВКМ Y-1585, Arxula adeninivorans ВКМ Y-2677, Arxula adeninivoransВГИ 78-6, Candida boidinii ВКМ Y-2356, Candida maltosa ВКМ Y-2359,Сandida blankii ВКМ Y-2675, культивировали на богатой минеральнойсреде (жидкая питательная глюкозо-пептонная среда). Состав жидкойсреды: глюкоза – 10 г/дм3 (OOO «Диаэм»), пептон – 5 г/дм3 (OOO«Диаэм»),дрожжевой экстракт – 0,5 г/дм3 (OOO «Диаэм»). ДрожжиOgataea angusta ВКМ Y-1397 культивировали на богатой минеральнойсреде (жидкая дрожжевая питательная среда).
Состав жидкой среды:дрожжевой экстракт – 0,1 г/дм3, лейцин – 0,034 г/дм3, глицерин – 1,66 см3,микроэлементы – 0,2 см3 (Sigma, США), вода дистиллированная – 200 см3.Средудлявкультивированияклетокстерилизовалиавтоклавированием при давлении в 1 атмосферу в течение 45 минут.Клетки культивировали аэробно 18-20 часов в качалочных колбах объемом750 см3 при температуре 29оС. Биомассудрожжей собиралицентрифугированием при 10000 об/мин 10 минут (центрифуга TG16WS,Поликом LTD, Россия) при комнатной температуре. Промываниебиомассы дрожжей проводили натрий-калий фосфатным буфером рН 6,8.Дрожжевыеклеткирассуспендировалибуфернымраствором,распределяли в микропробирках типа Eppendorf и центрифугировали на65центрифуге «Eppendorf» 5 минут при 10000 об/мин. Промытую биомассудрожжей хранили при температуре -25 С в микропроибирках.2.6 Проведение биосенсорных измеренийПринцип работы микробного сенсора на основе кислородногоэлектродаоснованнаиммобилизованныминамикроорганизмамитом,чтоповерхностивозрастаетихприокислениикислородногодыхательнаясубстратаэлектродаактивность,ивприэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, чторегистрируется с помощью электрода.В качестве преобразователя использовали многофункциональныйанализаторрН-метр-иономер-БПК-термооксиметрЭксперт-001-4.0.1(научно-производственная фирма «Эконикс-эксперт», Москва) в режиме«термооксиметр», что позволило производить непрерывную регистрациюсигнала (рисунок 10).Рисунок 10.
Макет БПК-биосенсораУправление прибором и обработка результатов проводилась спомощью встроенной программы «EXP2PR» (научно-производственнаяфирма «Эконикс-эксперт», Москва).Основнымэлементомбиосенсорногоанализатораявляетсякислородный электрод Кларка, на поверхности которого располагалибиорецепторный элемент (рисунок 11).661 – раствор электролита,2 – защитный колпачок,3 – биорецепторный элемент,4 – капроновая сетка,5 – полупроницаемая целлофановаямембрана,6 – корпус электрода,7 – электродРисунок 11.
Электрод с биорецепторным элементомПереднепосредственнымизмерениемпроводиласьпромывкакюветы буфером рН 6,8 (концентрация солей 33 мМ). После установлениястационарного режима добавляли определенный объем пробы с помощьюмикропипеток. После окончания измерения кювета снова промываласьбуфернымраствором,довосстановленияначальныхпараметров(содержание кислорода).
В ходе измерения на мониторе компьютераотображались изменения параметров системы, таких как зависимостьсодержания кислорода от времени. Обработка полученных результатовпроизводилась с помощью программы Excel. Измеряемым параметром(ответом биосенсора) являлась максимальная скорость (по модулю)изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстратов.2.7 Заполнение и проверка качества электрода КларкаКислородныйэлектродзаполнялирастворомэлектролита.Полупроницаемая мембрана электрода – целлофан.
Проверка качестваэлектродаосуществляласьспомощьюсвежеприготовленного20%раствора сульфита натрия. При растворении сульфита натрия в водепроисходит восстановление свободного кислорода по реакции:2 Na2SO3+O2=2Na2SO4Электродподключаликприбору«Эксперт-001»врежиме«термооксиметр» в кювету добавляли 20% раствор сульфита натрия и67запускали процесс измерения пробы. Критерием пригодности электрода кизмерениям являлось снижение содержаниякислорода в кювете до 0мг/дм3.2.8 Иммобилизация дрожжей с применением диализноймембраныДляформированиярецепторногоэлементапроводилипредварительное разбавление биомассы дрожжей фосфатным буфернымраствором в соотношении 1:1.
5 мкл полученной суспензии наносили надиализную мембрану D9777 (Sigma, США) и фиксировали на электроде спомощью резинового кольца (рисунок 12).Рисунок 12. Иммобилизация микроорганизмов на кислородномэлектроде с применением диализной мембраны: 1 – платиновый электрод;2 – серебряная проволока; 3 – суспензия дрожжей; 4 – газопроницаемаямембрана; 5 – диализная мембрана; 6 – резиновое кольцо фиксации; 7 –кислородный электрод с иммобилизованными микроорганизмами.682.9 Иммобилизация микроорганизмов в гидрогельмодифицированного поливинилового спиртаДля получения иммобилизованного биокатализатора к 100 мкл геляПВС модифицированного N-винилпирролидоном добавляли 5-60 мгклеток (смешанных в соотношении 1:1или 1:1:1 для ассоциацийсостоящих соответственно из 2-х или 3-х видов) микроорганизмов.Равномерногораспределенияклетоквгидрогеледобивалисьвстряхиванием на центрифуге Sky line Elmi Centrifuge & Vortex CM70M(ELMI, Латвия) в течение 5 минут.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
